Präparation der Genombibliothek: Warum schneidet das Restriktionsenzym nicht in das Gen?
Felix h.
Ich versuche derzeit, die Erstellung einer genomischen Bibliothek tiefergehend zu verstehen. In den meisten Lehrbüchern, die ich gelesen habe (sowie in Wikipedia), wird erwähnt, dass die genomische Bibliothek erstellt wird, indem die DNA isoliert und mit einem spezifischen Restriktionsenzym fragmentiert wird, das ungefähr so oft schneidet, wie es Gene gibt. Das kann aber nicht wirklich funktionieren, oder?
Nehmen wir an, E. coli hat 4000 Gene mit 4.600.000 bpsGenom. Das bedeutet, dass ich theoretisch Fragmente von mehr als 1150 bps erzeugen muss (wenn jedes Gen die gleiche Länge hat und keine anderen Sequenzen vorhanden sind). Das würde bedeuten, dass ich ein Restriktionsenzym brauche, das etwa 4000 Mal schneidet und über 1150 bps Fragmente erzeugt. Also würde ich entweder ein Restriktionsenzym mit einer Erkennungsstelle von 5 bps (Schnitte alle 1024 bps) oder mit 6 bps (Schnitte alle 4096) verwenden, natürlich nur, wenn die Basenpaare zufällig sind. Jetzt sehen Sie schon, mit dem ersten Restriktionsenzym werde ich (sogar in der Theorie) viele Gene durchschneiden, während ich mit dem zweiten vielleicht Gene der entsprechenden Größe bekomme, aber ich werde auch andere fragmentieren. Darüber hinaus sind die Gene, insbesondere in komplexeren Organismen, nicht gleichmäßig verteilt, sondern können in einigen Bereichen konzentriert sein, während in anderen nur sich wiederholende Sequenzen lokalisiert sind. Warum also wird in jedem Lehrbuch erwähnt, dass ich mit einem einzigen Restriktionsenzym eine vollständige genomische Bibliothek erstellen kann? Wäre es nicht sinnvoller, viele DNA-Kopien nach dem Zufallsprinzip zu scheren, so wie es bei der Shotgun-Sequenzierung gemacht wird, um eine höhere Abdeckung zu erzielen? Meine Frage ist also, wie wird eine genomische Bibliothek WIRKLICH erstellt, ohne etwas über die Sequenz zu wissen? Berücksichtigen Sie einfach, dass viele Gene in der Mitte abgeschnitten werden, und hoffen das Beste? Es scheint eine sehr seltsame Strategie zu sein, ganze Gene zu amplifizieren. Wie wird eine genomische Bibliothek WIRKLICH erstellt, ohne etwas über die Sequenz zu wissen? Berücksichtigen Sie einfach, dass viele Gene in der Mitte abgeschnitten werden, und hoffen das Beste? Es scheint eine sehr seltsame Strategie zu sein, ganze Gene zu amplifizieren. Wie wird eine genomische Bibliothek WIRKLICH erstellt, ohne etwas über die Sequenz zu wissen? Berücksichtigen Sie einfach, dass viele Gene in der Mitte abgeschnitten werden, und hoffen das Beste? Es scheint eine sehr seltsame Strategie zu sein, ganze Gene zu amplifizieren.
Danke schön! :)
Antworten (1)
Bob1
Eine genomische Bibliothek wird zum Zweck der Einkapselung der vollständigen genetischen Komponente eines Organismus erzeugt.
Sie tun dies, indem Sie das Genom mit einem Restriktionsenzym fragmentieren, das an seiner Erkennungssequenz schneidet. Diese Fragmente werden dann genommen und in ein Plasmid kloniert , so dass sie dann innerhalb des Plasmids unter Verwendung gemeinsamer Sequenzen sequenziert werden können, die auf dem Plasmid, aber (im Allgemeinen) nicht im Organismus selbst zu finden sind. Die Sequenzierung würde traditionell durch Sanger-Sequenzierung durchgeführt , bei der die Länge einer Sequenz begrenzt ist, die Sie auf einmal ausführen können. Eine wirklich gute Sequenzierung bringt Ihnen ~ 1000 bp, wobei die Sequenzqualität nach etwa 600 bp nachlässt.
Die genomische Bibliothek ist nicht zur Expression bestimmt – sobald Gene identifiziert sind, können sie in ein Expressionsplasmid subkloniert werden, um zu sehen, was sie tun. Zu diesem Zweck ist es also kein Problem, ein Gen in Fragmente zu schneiden, da Sie den Rest auf einem anderen Plasmid finden und das Gen in voller Länge rekonstruieren können, indem Sie die beiden Fragmente nehmen und zusammensetzen.
Der Grund, warum Sie das Restriktionsenzym verwenden, ist, dass die Sequenz, an der es schneidet, auch zum Einfügen in das Plasmid verwendet wird.
An diesem Punkt fragen Sie sich vielleicht, wie Sie die Enden von Genen (oder einer beliebigen Sequenz für diese Angelegenheit) abgleichen, wenn sie alle von einer identischen Sequenz geschnitten werden?
Nun, die Antwort ist, dass Sie mehrere Restriktionsenzyme verwenden, entweder einzeln oder in Kombination, um eine Vielzahl von Fragmenten zu erzeugen, die an verschiedenen Stellen geschnitten werden. Dies bedeutet, dass Sie, sobald Sie die Bibliotheken aus diesen verschiedenen Verdauungen erstellt haben, die verschiedenen Bibliotheken sequenzieren und herausfinden können, wo sich die Fragmente überlappen, und dann alle Sequenzen zu der ursprünglichen Sequenz zusammensetzen können.
Zum Beispiel, wenn Sie sich das Bild unten ansehen. Wenn Sie sich vorstellen, dass die schwarzen Kästchen dasselbe Gen sind und das obere mit dem Restriktionsenzym A und das untere mit B geschnitten ist, können Sie sehen, dass die beiden Restriktionsenzyme überlappende Fragmente erzeugen, wenn Sie also die Fragmente von beiden sequenzieren Restriktionsenzymen können Sie feststellen, wo die Enden in A mit anderen in A übereinstimmen, indem Sie sich die Fragmente in B ansehen.
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Felix h.
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