Pyura-DNA-Extraktion

Ich kämpfe mit der genomischen DNA-Extraktion aus verschiedenen Proben von Pyura chilensis ; die DNA wird abgebaut, wie auf dem Gel zu sehen ist.

Wir haben immer das GeneJET Genomic DNA Purification Kit (von ThermoFisher) verwendet, und es funktioniert gut für Proben von anderen Arten; Also der Bausatz ist nicht das Problem.

Wir haben immer in 95 % Ethanol gelagerte Gewebeproben verwendet (die vor der DNA-Extraktion mit Wasser gewaschen wurden), aber das Problem bleibt bestehen, unabhängig davon, ob die Proben einen Tag oder einige Jahre alt sind. Die Aufbewahrungsmethode scheint für die gDNA-Extraktion aus anderen Arten gut zu funktionieren.

Dann ist meine Vermutung, dass das Problem bei Pyura selbst liegt. Also muss ich herausfinden, ob entweder die Extraktion oder die Lagerung nicht für Pyura geeignet ist. Ich habe gelesen, dass Pyura viel Kupfer enthält. Wir planten, einen neuen Puffer für die Lagerung zu verwenden: salzgesättigtes DMSO, das EDTA enthält.

Ich würde gerne fragen, ob jemand von Ihnen jemals mit diesem Organismus gearbeitet hat (und wenn ja, wie haben Sie es dann geschafft, DNA daraus zu extrahieren). Haben Sie Vorschläge zu DNA-Reinigungsprotokollen?

Geben Sie hier die Bildbeschreibung einDie 1. Spur ist die Leiter (1 kb) und die letzten 3 Spuren mit langem verschwommenem Ding anstelle von Bändern sind meine DNA-Proben.

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In Bezug auf Ihr Gelfoto sieht die genomische DNA (in den drei Pyura-Probenspuren) nicht stark abgebaut aus. Wenn der Größenmarker eine 1-kb-Leiter ist, dann ist der Großteil der DNA von hoher molekularer Größe. Während der Extraktion ist es üblich, dass DNA mit hohem Molekulargewicht bis zu einem gewissen Grad "geschoren" wird (mechanisch in kleinere Fragmente zerlegt). Dies kann als schwacher Abstrich nach unten erscheinen . Die Fahrspuren können auch etwas überlastet sein. Sie können versuchen, eine sanftere Extraktionstechnik anzuwenden und sehen, ob sie zu Ihrer Zufriedenheit hilft. Jeder von denen, die Sie erwähnen, wird funktionieren.

Stark abgebaute genomische DNA würde als intensiverer "Schmier" in der Nähe des unteren Teils des 1-kb-Größenstandards erscheinen.

Dies ist aus einer veröffentlichten Arbeit von Segovia et al. 2017 :

Mantelgewebe (0,2 g) von jedem Individuum wurde verwendet, um DNA unter Verwendung des DNeasy Blood® & Tissue Kit (QIAGEN®, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren. Menge/Reinheit der DNA wurde in Nanodrop 2.000 (Thermo, USA) gemessen.

Sie haben die SNP-Identifizierung aus dem Genom durchgeführt. Ich gehe also davon aus, dass ihre gDNA von anständiger Qualität gewesen wäre.

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