Signalisierung durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren?

BEARBEITETE ANTWORT

Basierend auf den Kommentaren und Antworten, die meine ursprüngliche Antwort auf diese Frage erhalten hat, habe ich beschlossen, die Antwort zu bearbeiten und auf einige Fragen zu antworten.

Da ich mit Proteinen arbeite, tendiere ich dazu, proteinbasierte Ansätze zu bevorzugen, besonders wenn ich mich über das Vorhandensein eines Proteins wundere. Dies ist einfach der Fall, weil Protein funktionell wichtig ist (ich spreche hier nur über proteinbasierte Probleme/Fragen und nicht über RNAi-Sachen), also was ich erfahrene Redakteure für die meisten Artikel fordern, sie wollen eine Art Protein sehen Arbeit. Jetzt ist mir bewusst, dass dies nicht immer möglich ist, da der Antikörper (Ab) möglicherweise nicht sehr spezifisch oder empfindlich ist, insbesondere für schwach exprimierende Proteine. Wenn ein Protein sehr kurzlebig ist, verschlimmert das das Problem noch, Aus diesem Grund greifen viele Menschen auf die mRNA-Expression zurück, um auf das Vorhandensein von Proteinen zu schließen, obwohl dies eine Reihe von Annahmen darüber macht, wie die mRNA verarbeitet wird und ob die Beziehung zwischen mRNA-Expression und Proteinexpressionsniveau linear ist, aber das ist eine andere Diskussion. Ich versuche also nur zu sagen, dass es wichtig ist, das Vorhandensein eines Proteins mit Ab-basierten Techniken zu überprüfen, bei denen es sich um Immunhistochemie (IHC) und Western-Blot (WB) handelt.

Meine primäre Empfehlung ist daher, Gi- und Gs-speziesspezifische (nicht kreuzreaktive) Antikörper zu verwenden, um das Vorhandensein Ihrer interessierenden Proteine ​​​​zu überprüfen, und immer eine Ab-Schwerkettenkontrolle für IHC und eine Negativkontrolle für Ihren WB mit einer von Ihnen erstellten Probe zu verwenden wissen, drückt Ihre interessierenden Proteine ​​​​nicht aus, falls verfügbar. IHC teilt Ihnen auch einige räumliche Informationen mit und ob Gs und Gi beide in derselben Zelllinie vorhanden sind oder nicht und ob sie sich gemeinsam lokalisieren usw. usw.! Überprüfen Sie natürlich die Verfügbarkeit von Ab und ob es mit IHC- oder WB-Verfahren kompatibel ist.

Die andere praktikable Methode ist, wenn Sie wissen, dass Ihre zwei verschiedenen Zellen nur eines der Gs oder Gi ausschließlich exprimieren, können Sie sich ihre spezifischen Inhibitoren ansehen und es einigen Ihrer Zellen hinzufügen, und die Chancen stehen gut, wenn die Dosis hoch genug ist es führt zum Absterben der Zellen, da Gs oder Gi für die Zellfunktion entscheidend sind. Sie können wahrscheinlich mit einem Experiment wie diesem davonkommen, indem Sie Vertiefungen in einer 24-Well-Schale verwenden, sodass Sie nicht so viele Medien oder Medikamente verwenden müssen. Aber mit solchen Dingen funktioniert es möglicherweise nicht und Sie erhalten möglicherweise Off-Target-Effekte, also tun Sie dies einfach als ergänzenden Test. Führen Sie für Ihren Drogentest immer eine DMSO-Kontrolle durch, da die Chancen gut stehen, dass die Drogen darin gelöst sind, und wenn nicht, verwenden Sie einfach das Lösungsmittel, in dem die Drogen gelöst sind, und fügen Sie sie Ihren Zellen in Ihren Kontrollexperimenten hinzu.

Die andere mögliche und häufig verwendete Methode, um die Genexpression eines Proteins zu überprüfen und anschließend auf sein Vorhandensein als Protein zu schließen, ist die Verwendung einer auf reverser Transkription basierenden PCR wie RT-PCR, obwohl dies nicht in Echtzeit erfolgen muss in den Kommentaren richtig erwähnt. Bitte beachten Sie, dass ich diesbezüglich überhaupt kein Experte bin und überprüfen Sie meine Antwort in diesem Abschnitt, da ich persönlich keine auf Reverse Transkription basierende PCR durchgeführt habe. Soweit mir bekannt ist, besteht das grundlegende Verfahren darin, zelluläre mRNA zu extrahieren, was mit Kits wie RNeasy oder einem ähnlichen Produkt durchgeführt werden kann (ich bewerbe hier keine Produkte und dies sind nur die, auf die ich gestoßen bin!) . Die Protokolle werden mit den Kits geliefert und sind online verfügbar. und sagt Ihnen genau, welche minimale/maximale Zellzahl/RNA-Level vorhanden sein sollten und wie Ihre Zellen vor der Verarbeitung (pelletiert) sein sollten. Eine andere Methode zur RNA-Extraktion ist CsCl, aber das ist ziemlich chaotisch und kompliziert und erfordert viel Fachwissen, um es richtig zu machen, aber ich weiß, dass es in bestimmten Situationen unvermeidlich ist, aber für die Zellverarbeitung reicht ein Kit aus. Zumindest besagt das RNeasy-Protokoll, dass es mRNA anreichert und andere Arten von RNA selektiv ausschließt. Sobald Sie Ihre zelluläre mRNA haben, können Sie mit der reversen Transkription fortfahren, indem Sie die entsprechend entworfenen Primer für Ihr interessierendes Gen mit einem Thermocycler verwenden. Auch hier bin ich mir nicht sicher, welche Tools ich zum Entwerfen der Primer für die Herstellung von cDNA aus mRNA verwenden soll und wonach ich suchen soll (abgesehen von der Tatsache, dass Ihre Primer spezifisch sind), da ich nur normale PCR durchführe, aber Änderungen begrüßen würde! Sobald Sie von mRNA zu cDNA gelangen, können Sie sie dann auf Ihrem (Ethidiumbromid oder was auch immer auf DNA-Färbung basierenden) Agarosegel laufen lassen und sehen, ob Ihr Amplikon vorhanden ist und die richtige Größe hat (wieder basierend auf den von Ihnen ausgewählten Primern, die Sie wissen würden was die richtige Größe ist) und ob Ihr Gen exprimiert wird oder nicht. Zumindest sagt das RNeasy-Kit, dass Sie keinen DNase-Verdau verwenden müssen, um DNA zu entfernen, bevor Sie Ihre mRNA rückwärts transkribieren, da das meiste davon bei der Verwendung des Kits bereinigt wird, aber Sie haben diese Option. In Bezug auf die RNA-Sequenzierung der nächsten Generation weiß ich nichts über sie, daher würde ich erneut Änderungen begrüßen, erscheint aber unnötig, da Sie nur wissen möchten, ob das interessierende Gen exprimiert wird, also keine Sequenzinformationen benötigen, aber das ist auch eine Option (obwohl ich mir ein wenig teuer vorstelle?). Um nur etwas sehr Offensichtliches zu erwähnen, es ist wichtig, dass die Spezies, aus der Ihre Linien generiert wurden, sequenziert sind oder Sie gute Sequenzinformationen über die Gs- und Gi-Gene in Ihren Linien haben, sonst wäre das Entwerfen von Primern ein Ratespiel. Es ist immer am besten, zu sehen, ob jemand das getan hat, was Sie versuchen, und nach seinen Primern zu fragen, da die meisten Menschen gerne Reagenzien teilen.

Nun, Sie haben wahrscheinlich bisher bemerkt, dass meine Methoden ziemlich auf molekularbiologische Ansätze ausgerichtet sind, und das liegt einfach daran, dass ich mehr darüber weiß, aber ein großartiger Vorschlag war, cAMP-Spiegel als Indikator für die Gs- oder Gi-Expression zu verwenden. Auch hier bin ich kein Experte, da ich kleine Moleküle noch nie analysiert habe, aber ich stelle mir vor, dass dies so etwas wie eine HPLC beinhaltet, die Sie mit einem Chemiker / Biochemiker besprechen müssen, wie Sie Ihre Zellen aus allem extrahieren und reinigen und verlassen können nur das cAMP. Es gibt wahrscheinlich ein Verfahren/ein Kit/einen Biosensor dafür, aber ich werde es vermeiden, darauf einzugehen, da ich praktisch nichts darüber weiß. Ich möchte jedoch bei dieser Art von indirekten Experimenten warnen. Ich habe keine Ahnung, was Ihre Zelllinien sind und wie gut sie charakterisiert sind, aber da Linien alle möglichen Mutationen und Deletionen und Insertionen enthalten, ist es keine gute Idee, Rückschlüsse auf cAMP-Spiegel zu ziehen. Da die Berücksichtigung des cAMP-Vorhandenseins für die Zellfunktion ziemlich wichtig ist, sind ihre absoluten Werte in einer Zelllinie nicht unbedingt ein guter Indikator dafür, ob ein cAMP-Produktionsregulator vorhanden ist oder nicht, und ich bin sicher, wenn Sie so etwas tun, öffnen Sie sich für größere Kritik von Zeitschriftenredakteuren/Gutachtern. Was jedoch bei zukünftigen Experimenten mit diesen Zellen eine gute Idee sein wird, ist, Gs oder Gi zu stark zu exprimieren und ihre Auswirkungen auf die cAMP-Produktion zu sehen, aber ich empfehle nicht, cAMP-Spiegel als alleinigen Indikator dafür zu verwenden, ob Gs oder Gi ausgedrückt wird oder nicht. Es ist keine gute Idee, Rückschlüsse aus cAMP-Spiegeln zu ziehen. Da die Berücksichtigung des cAMP-Vorhandenseins für die Zellfunktion ziemlich wichtig ist, sind ihre absoluten Werte in einer Zelllinie nicht unbedingt ein guter Indikator dafür, ob ein cAMP-Produktionsregulator vorhanden ist oder nicht, und ich bin sicher, wenn Sie so etwas tun, öffnen Sie sich für größere Kritik von Zeitschriftenredakteuren/Gutachtern. Was jedoch bei zukünftigen Experimenten mit diesen Zellen eine gute Idee sein wird, ist, Gs oder Gi zu stark zu exprimieren und ihre Auswirkungen auf die cAMP-Produktion zu sehen, aber ich empfehle nicht, cAMP-Spiegel als alleinigen Indikator dafür zu verwenden, ob Gs oder Gi ausgedrückt wird oder nicht. Es ist keine gute Idee, Rückschlüsse aus cAMP-Spiegeln zu ziehen. Da die Berücksichtigung des cAMP-Vorhandenseins für die Zellfunktion ziemlich wichtig ist, sind ihre absoluten Werte in einer Zelllinie nicht unbedingt ein guter Indikator dafür, ob ein cAMP-Produktionsregulator vorhanden ist oder nicht, und ich bin sicher, wenn Sie so etwas tun, öffnen Sie sich für größere Kritik von Zeitschriftenredakteuren/Gutachtern. Was jedoch bei zukünftigen Experimenten mit diesen Zellen eine gute Idee sein wird, ist, Gs oder Gi zu stark zu exprimieren und ihre Auswirkungen auf die cAMP-Produktion zu sehen, aber ich empfehle nicht, cAMP-Spiegel als alleinigen Indikator dafür zu verwenden, ob Gs oder Gi ausgedrückt wird oder nicht. Ihre absoluten Werte in einer Zelllinie sind nicht unbedingt ein guter Indikator dafür, ob ein cAMP-Produktionsregulator vorhanden ist oder nicht, und ich bin sicher, wenn Sie so etwas tun, werden Sie sich der großen Kritik eines Zeitschriftenherausgebers/Gutachters aussetzen. Was jedoch bei zukünftigen Experimenten mit diesen Zellen eine gute Idee sein wird, ist, Gs oder Gi zu stark zu exprimieren und ihre Auswirkungen auf die cAMP-Produktion zu sehen, aber ich empfehle nicht, cAMP-Spiegel als alleinigen Indikator dafür zu verwenden, ob Gs oder Gi ausgedrückt wird oder nicht. Ihre absoluten Werte in einer Zelllinie sind nicht unbedingt ein guter Indikator dafür, ob ein cAMP-Produktionsregulator vorhanden ist oder nicht, und ich bin sicher, wenn Sie so etwas tun, werden Sie sich der großen Kritik eines Zeitschriftenherausgebers/Gutachters aussetzen. Was jedoch bei zukünftigen Experimenten mit diesen Zellen eine gute Idee sein wird, ist, Gs oder Gi zu stark zu exprimieren und ihre Auswirkungen auf die cAMP-Produktion zu sehen, aber ich empfehle nicht, cAMP-Spiegel als alleinigen Indikator dafür zu verwenden, ob Gs oder Gi ausgedrückt wird oder nicht.

Wenn alles andere fehlschlägt und Sie müde wurden und Ihre Hände von dieser Identifizierungsaufgabe waschen wollten, können Sie Ihre Zellen immer noch lysieren und sie zur Massenspektrometrie (MS) schicken, wenn es eine solche Einrichtung an Ihrem Institut gibt. Es ist entscheidend, dass die Arten, von denen Ihre Linien stammen, hinsichtlich ihrer globalen Proteinsequenzen charakterisiert werden, da Programme wie Mascot die rohen Spektraldaten gegen Datenbanken wie UniProt abfragen, um Proteinabdeckung und anschließend Proteintreffer zu erhalten. Auch bevor Sie mit Ihren MS-Experimenten fortfahren, sprechen Sie einfach mit dem Facility Manager und fragen Sie nach Rat, in welchem ​​Lysepuffer Ihre Zellen am besten lysiert werden und welche Komponenten nicht in Ihrem Lysepuffer enthalten sein sollten und wie empfindlich ihre Maschinen sind und wie wahrscheinlich werden Sie erkannt und wie hoch Ihre Proteinkonzentration sein sollte. Ich denke, die beste Maschine ist Orbitrap, und als allgemeine Regel gilt, je höher die Proteinmenge, desto wahrscheinlicher ist es, dass Sie sie erkennen. Da Zelllysat ziemlich chaotisch ist und die Säulen der MS-Maschine durch reichlich vorhandene Proteine ​​wie Aktin gesättigt werden können, wäre es am besten, Ihre Lysate unter reduzierenden Bedingungen auf einem SDS-PAGE-Gel laufen zu lassen (Sie können sogar mehrere Ladungen durchführen, indem Sie Ihre Proben hineinlaufen lassen das Gel, schalten Sie die WB-Maschine aus, laden Sie weitere Proben und lassen Sie sie in das Gel laufen und fahren Sie einige Male fort. Es funktioniert, ich habe es selbst gemacht, aber für heruntergezogene Proben, die etwas sauberer sind (weniger Verunreinigungen / unerwünschte Proteine ) Im Algemeinen). Sobald Ihr Gel durchläuft, schneiden Sie einfach den Bereich des Gels, der den Molekulargewichten von Gs und Gi entspricht, und senden Sie diesen zur MS-Identifizierung. Diese Methode (Durchlauf Ihres Lysats durch ein SDS-PAGE-Gel) beseitigt unerwünschte Proteine, die den Identifizierungsprozess stören können. Aber MS ist sehr teuer!

Auch hier würde ich jede Bearbeitung meiner eigenen bearbeiteten Antwort sehr begrüßen! Ich bin hier, um zu helfen und zu lernen.

Da Experimente zu schwierig und kostspielig sind, brauchen Sie das nicht zu tun.

Proben nehmen, beschriften und dann Liganden und Nahrung auftragen. Die Hemmstoffe haben eine langsamere Wachstumsrate, nicht den Tod, und verwenden eine Kontrolle mit Replikaten. Auch wenn Sie das Geld haben, kaufen Sie ein epac FRET, um cAMP zu messen. Finde jemanden, der den FRET macht, wenn du es nicht kannst. Es wird länger als einen Tag dauern, aber Sie vermeiden das Ganze, ich habe ihm zu viel gegeben, es würde sowieso sterben. Wenn Sie Ihre Zelllinien ursprünglich nicht nach Proteinen getrennt haben und eine Mischung von Gs Gi innerhalb der Zelllinien haben und Sie herausfinden müssen, welcher Ligand eine dominante Reaktion hervorruft, müssen Sie diese Tests einzeln durchführen. Es gibt Unternehmen, die sich auf Wachstumsreaktionen spezialisiert haben.

Wenn nicht FRET. Finden Sie ein Geschäft mit einem ION-Torrent und sequenzieren Sie das Genom , es ist wirklich sehr billig. Wenn Ihre Proteine ​​eine bekannte Homologie zu Gs oder Gi haben, wird dies am schnellsten die besten Ergebnisse liefern. Wenn Ihre Proteinfunktion neu ist, fügen Sie Liganden hinzu und der Gi hat weniger PCR-Verstärkung als der Gs. Machen Sie nicht Ihre eigene NA-Extraktion, lassen Sie sie einfach. Ich habe gesehen, dass so viele Proben bei der Lieferung schlecht wurden, weil die Leute versuchten, Geld zu sparen.

Da Sie Probleme hatten, dieses Experiment zu entwerfen, finden Sie außerdem eine Firma, die das gesamte Experiment für Sie durchführt. Die meisten Orte mit ION-Torrents haben das gesamte Labor eingerichtet, um ein solches Experiment durchzuführen, und dies auf wöchentlicher Basis.