Ich habe versucht herauszufinden, welcher Sigmafaktor für die Transkription von RNA-Polymerase-Untereinheiten verantwortlich ist (rpoA) und (rpoC) in Bacillus subtilis . Ich würde erwarten, dass es das Housekeeping ist . Allerdings habe ich aus der Transkriptionsfaktor-Datenbank von Bacillus subtilis herausgefunden , dass Bindungsstellen wurden in den Promotoren von gefunden (rpoB) und (rpoE)-Untereinheiten und eine ganze Reihe von Alternativen Faktoren, aber es sagt nichts darüber aus oder .
Also möchte ich wissen, ob es eine Möglichkeit für mich gibt, das herauszufinden, ohne ein Nasslabor zu betreten!
Zuerst; Woher wissen wir, dass etwas eine Transkriptions-/Sigmafaktor-Bindungsstelle ist? Was hat es mit der Region auf sich? Und woher wissen wir, für welches TF/SF es eine Bindungsstelle ist? Könnte derselbe Transkriptions-/Sigmafaktor mehrere unterschiedliche Bindungsstellenmotive haben?
Zweitens; Da das Genom für B. subtilis verfügbar ist, wäre ich in der Lage, Bindungsstellenmotive für alle Sigma-Faktoren herauszufinden und dann zu bestimmen, welche im Promotor für enthalten sind Untereinheit? Dh wenn ich die TF/SF-Sequenz kenne, gibt es eine Möglichkeit herauszufinden, an welche Promotoren sie binden kann?
Endlich; Der Hauptzweck dieser Frage besteht darin, herauszufinden, wie rpoA transkribiert wird, und ich weiß, dass im Allgemeinen Sigma-Faktoren in Bakterien für die spezifische Transkriptionsinitiation erforderlich sind, aber könnte es sein, dass die rpoA-Transkription unspezifisch ist und dass der Sigma-Faktor es ist nur nicht an seiner Transkription beteiligt?
Bitte lassen Sie mich wissen, ob ich etwas tun kann, um meine Frage zu verbessern. Ich kann Referenzen angeben, wenn dies eine gute Idee wäre. Vielen Dank!
Ich habe keine endgültige Antwort, aber ich kann vielleicht einen Einblick geben. Angesichts der notwendigen Funktion von rpoA würde ich darauf wetten, dass SigA der Faktor ist, der für seine Transkription verantwortlich ist, also werde ich meine Diskussion darauf konzentrieren.
Die Vorhersage von Promotoren ohne Experimente kann angesichts ihrer immensen Variabilität sehr schwierig sein. Der idealisierte Core-Promotor besteht aus einer -10-Region, einem Spacer und einer -35-Region. Die Erkennung des Promotors durch einen Sigmafaktor erfolgt in den Regionen –10 und –35: Jeder Sigmafaktor erkennt eine andere Consensus-Sequenz. Bacillus subtilisSigA erkennt die Consensus-Sequenzen TTGACA (-35) und TATAAT (-10). Über das Schlüsselwort besteht jedoch Konsens, da es selten vorkommt, dass ein Promotor tatsächlich genau diese Sequenzen enthält. In Wirklichkeit könnte eine 3/6-Nukleotidübereinstimmung als vernünftig angesehen werden. Zwischen den Regionen –10 und –35 befindet sich ein Spacer mit konservierter Länge. In Abwesenheit von Transkriptionsaktivatoren benötigt SigA einen Spacer von 17 +/- 1 Nukleotiden. Dies liegt an thermodynamischen Beschränkungen. Kurz gesagt, das Schmelzen des Promotors (bei –10) ist vom Winkel zwischen den Regionen –10 und –35 abhängig. Angesichts der helikalen Natur der DNA hängt dieser Winkel wiederum vom Abstand zwischen den Regionen –10 und –35 ab. Wenn der Winkel genau richtig ist, liefert das Aufdrehen der DNA, um die Promotorelemente auszurichten und somit eine Sigma-Bindung zu ermöglichen, die Energie, um den Promotor zu schmelzen. Wenn der Winkel zu groß ist, die Regionen können sich niemals ausrichten. Wenn der Winkel zu klein ist, liefert die Ausrichtung nicht genügend Energie zum Schmelzen. Kompliziert wird dies durch nicht standardmäßige Kernpromotoren und verschiedene flankierende Sequenzen, die alle eine Rolle bei der Transkriptionsinitiation spielen. Als direkte Antwort auf eine Ihrer Fragen kann ein einzelner Sigmafaktor an viele verschiedene DNA-Sequenzen mit einigen konservierten Regionen binden.
Glücklicherweise wurde das Genom von B. subtilis sequenziert. Ihre Suche nach dem Promotor könnte die Suche nach den -10- und -35-Regionen 5' zum rpoA-Gen umfassen. Dies berücksichtigt jedoch nicht, dass rpoA Teil eines polycistronischen Operons und somit unter der Kontrolle eines Promotors weiter stromaufwärts sein könnte. Suh et al. (1986) taten dies im Wesentlichen und berichteten:
Unsere DNA-Sequenzanalyse schlägt weitere Experimente vor, um die Regulation innerhalb der rpoA-Region zu untersuchen. Da die Hemmung der Translation der polycistronischen Botschaft durch das freie Protein S4 eine der Hauptkontrollen der alpha-Operon-Expression in E. coli ist (16, 23), legt das offensichtliche Fehlen von S4 in der alpha-Region von B. subtilis eine andere Regulation nahe. Obwohl die enge Kopplung der rpsM- und rpsK-Gene in unserer Sequenz (Abb. 3) die Vorstellung einer translationalen Kopplung ähnlich wie bei E. coli unterstützt, sind die mutmaßlichen rpoA-Promotoren in dem relativ großen intercistronischen Abstand nach rpsK ebenfalls unterschiedlich (28, 29 ). Das offensichtliche Fehlen eines rho-unabhängigen Terminators in dieser Region könnte jedoch darauf hindeuten, dass eine signifikante Transkription von zusätzlichen stromaufwärts gelegenen Promotoren in B. subtilis sowie in E. coli stattfindet (28).
Dies ist zwar eine alte Arbeit, aber neuere Studien konnte ich bei meiner schnellen Recherche nicht finden. Grundsätzlich verglichen sie das rpoA-Gen von B. subtilis mit dem von Escherichia coli , wo es in einem Operon mit den ribosomalen Proteinen rpsM, rpsK, rpsD und rplQ (unter der Kontrolle eines einzigen Promotors) lokalisiert ist. Sie fanden sowohl Gemeinsamkeiten als auch Unterschiede. Sie konnten zwei mögliche SigA-Core-Promotoren in der Region zwischen rpoA und rpsK finden (das nächste Gen 5' zu rpoA in B subtilis). Es gab auch einen relativ großen Abstand zwischen den beiden Genen, was darauf hindeutet, dass sie nicht Teil desselben Operons sind. Außerdem konnten sie eine Ribosomenbindungsstelle (Shine-Dalgarno-Sequenz) zwischen den hypothetischen Promotoren und der Translationsstartstelle finden. Andererseits gibt es keinen Transkriptionsterminator zwischen rpsK und rpoA, was vermuten lässt, dass ein Promotor weiter stromaufwärts die rpoA-Expression reguliert. Nach ihrer Sequenzanalyse schlugen sie vor, dass weitere Experimente erforderlich seien.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es schwierig ist, Promotoren zu finden, indem man sich nur die Sequenz ansieht. Selbst wenn Sie einen möglichen Promotor finden, ist es ohne Experimentieren unmöglich zu sagen, ob er verwendet wird oder nicht. Angesichts der Tatsache, dass die Alpha-Untereinheit für die Zellfunktion notwendig ist, scheint das rpoA-Gen transkriptionell an ribosomale Proteine gebunden zu sein (die auch für die Zellfunktion notwendig sind) und dass SigA der vorherrschende Faktor in der log-Phase von B. subtilis , I glauben, dass es sehr wahrscheinlich ist, dass SigA letztendlich der Faktor ist, der für die rpoA-Expression verantwortlich ist
Ich dachte auch, ich erwähne, dass es verschiedene Online-Bioinformatik-Tools gibt, die versuchen, Promotoren vorherzusagen, aber ich werde sie nicht weiter kommentieren, weil ich sie nicht verwendet habe.
Shigeta