Welche Verfahren würde ich verwenden, um Integrase zu isolieren und zu amplifizieren? Wenn ich versuche, das Integrase-Enzym zu untersuchen, das in HIV gefunden wird, wie würde ich 1) die Viruskapsel zerstören, um ihren Inhalt freizusetzen? 2) Trennung von Integrase von anderen Enzymen und der viralen DNA. 3) Kopien des Enzyms zum Testen erstellen. Jede Hilfe wäre sehr willkommen!!
Jedes Virus würde extrem geringe Mengen an Enzym enthalten (wahrscheinlich bestenfalls ein paar einzelne Moleküle); das Sammeln und Konzentrieren von genügend Viren, um eine signifikante Menge an Enzym zu extrahieren, wäre langwierig und schwierig, wenn überhaupt möglich.
Die übliche Strategie in Forschungslabors besteht darin, die für dieses Protein kodierende Nukleinsäuresequenz zu klonieren (entweder durch direkte Amplifikation aus einer HIV-infizierten Zelle oder durch Synthese eines DNA-Stücks in vitro) und in einen Expressionsvektor zu integrieren, d. h . ein größeres DNA-Stück, normalerweise kreisförmig, geeignet für die Integration in eine Wirtszelle (menschlich oder sogar bakteriell) und das die für die Persistenz und Genexpression erforderlichen Sequenzen trägt. Auf diese Weise können Sie Tausende von Kopien des Enzyms, an dem Sie interessiert sind, in jeder Zelle herstellen und dann eine beträchtliche Menge an Integrase reinigen, um sie zu untersuchen.
Um die Reinigung zu erleichtern, ist es üblich, dem Gen eine Sequenz hinzuzufügen, die für ein "Reinigungs-Tag" codiert, dh einige zusätzliche Aminosäuren, die spezielle Eigenschaften haben, die die Reinigung des endgültigen Proteins erleichtern. Strecken von 6–8 Histidinresten werden sehr häufig verwendet. Die Annahme ist, dass das Protein, das dieses Tag trägt, nach der Reinigung eine ähnliche Aktivität wie das natürliche Enzym haben wird.
David