Wenn E. coli mit einem genetisch veränderten Plasmid transformiert wird, wie schnell/oft geht dieses Plasmid aufgrund von Mutation, horizontalem Transfer oder „Verdünnung“ durch Reproduktion über mehrere Generationen „verloren“?
Wie oft gehen eingefügte Plasmide in E. coli verloren/mutiert/verdünnt? Wie lange würden Sie erwarten, die Ausgabe der Plasmide nach der Transformation zu beobachten?
Es gibt viele Faktoren, die die Stabilität eines Plasmids beeinflussen können. Ich werde die Hauptfaktoren beschreiben, aber um genau herauszufinden, wie stabil Ihr Plasmid ist, müssen Sie es leider nur testen. Ich habe Links zu einigen Studien gegeben, die dies am Ende tun.
Die Kopienzahl bezieht sich darauf, wie viele Kopien Ihres Plasmids in jeder Zelle vorhanden sind. Dies kann von 1–10 für Plasmide mit niedriger Kopienzahl bis zu 300–500 für Plasmide mit hoher Kopienzahl reichen. Im Allgemeinen können Plasmide mit niedriger Kopienzahl leichter verloren gehen als Plasmide mit hoher Kopienzahl, da eine höhere Wahrscheinlichkeit besteht, dass das Plasmid nach der Teilung nicht in einer der Zellen vorhanden ist. ( https://www.nature.com/articles/s41598-017-05219-x )
Sehr große Plasmide (im Megabasenbereich) neigen dazu, weniger stabil zu sein als kleinere Plasmide, da Organismen, insbesondere E. coli , Schwierigkeiten haben können, sie zu replizieren. Dies bedeutet, dass im Laufe der Zeit weniger Plasmid in Ihrem System vorhanden sein wird. ( https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00008 )
Typischerweise weisen synthetische Plasmide einen codierten Selektionsmarker auf, der verwendet wird, um einen selektiven Druck zum Halten des Plasmids bereitzustellen. Der genaue verwendete Marker kann die Stabilität des Plasmids beeinflussen, da einige wirksamer sind als andere. Dieses Papier hat einen guten Vergleich von zwei verschiedenen Markern und misst die Stabilität von Plasmiden für jeden: https://bmcbiotechnol.biomedcentral.com/articles/10.1186/1472-6750-8-61 .
Plasmide enthalten normalerweise ein Insert, das Ihr System codiert. Einige Inserts haben eine relativ geringe Belastung für die Zelle (z. B. geringe Expression eines kleinen Proteins). Andere können eine hohe Expression vieler Proteine oder Proteine beinhalten, die für die Zelle toxisch sind. Mutationen sind viel wahrscheinlicher in Plasmiden mit hoher Belastung im Vergleich zu Plasmiden mit geringer Belastung. Dies liegt daran, dass Zellen, die Plasmide mit Mutationen enthalten, die die Expression reduzieren/stoppen, einen viel höheren Fitnessvorteil gegenüber Zellen mit nicht mutierten Plasmiden haben werden. Ein anderes Mal werden diese mutierten Plasmide dominant und Sie verlieren schließlich Ihr ursprüngliches Plasmid. Hier ( https://2019.igem.org/Team:Austin_UTexas/Measurement ) und hier ( https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25849635/ ) gibt es einige gute Lektüre zur Zellbelastung .
Dies ist anekdotisch, aber ich habe es geschafft, 24-Stunden-Experimente mit Plasmiden mit einer Größe von etwa 5 kb durchzuführen, die ein Insert mit geringer Belastung enthielten, und ohne einen Selektionsmarker zu verwenden, ohne einen Plasmidverlust zu sehen. Ich hatte auch Probleme, Plasmide von ungefähr der gleichen Größe zu klonen, aber mit Antibiotikaselektion und einem Insert mit hoher Belastung, ohne dass Mutationen auftraten. Es hängt also wirklich davon ab, was Ihr Plasmid ist und was es exprimiert.
Hier sind einige Beispiele, wie Sie die Plasmidstabilität messen können:
MikeyC