Wie wurden die ersten Primer hergestellt?

Der synthetische Chemiker Gobind Khorana vom MIT erhielt 1968 den Nobelpreis für Chemie für seine Arbeit, mit der er erfolgreich Ketten aus Ribonukleinsäuren herstellen konnte. Die Chemie war damals schwierig, aber er gewann den Preis für die Herstellung spezifischer Sequenzen von RNA-Basen, die dann Zellen zugeführt wurden, was zu spezifischen Aminosäureketten führte, die letztendlich die spezifische Base-zu-Aminosäure-Korrespondenz des genetischen Codes entschlüsselten.

Khorana war nur einer der Chemiker, die an der Nukleotidsynthese gearbeitet haben , aber die Technik insgesamt ist einfach, und da Nukleinsäurepolymere nur unverzweigte Polymere sind, kann jede Sequenzkombination leicht erhalten werden. Jede aufeinanderfolgende Reaktion fügt eine Base hinzu. Wiederholen Sie die Reaktion so oft wie nötig.

Die von Khorana entwickelte Chemie wurde verfeinert und leicht auf DNA-Polymere ausgedehnt, da die Bindungen identisch sind, der Unterschied zwischen DNA und RNA nur eine einzige Alkoholgruppe (-OH) ist, die nicht direkt an der Bindung zwischen den Nukleotidbasen beteiligt ist.

Als Kary Mullis 1983 die Idee der PCR entwickelte, konnten kurze DNA- und RNA-Sequenzen auf handelsüblichen Maschinen synthetisiert werden. Tatsächlich war Mullis für eine solche Maschine bei Cetus Pharmaceuticals verantwortlich und hatte versucht, einen Weg zu finden, die Nachfrage nach seinen Dienstleistungen zu steigern.

Die PCR-Oligos waren der einfache Teil der Operation. Um das Konzept zu beweisen, verwendete das Team von Cetus eine herkömmliche DNA-Polymerase und fügte sie nach jedem Zyklus dem PCR-Mix hinzu. Bis 1986 war es dem Cetus-Team gelungen, eine PCR einer hitzetoleranten DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus, einem Bakterium aus einer heißen Quelle, durchzuführen, was es im Grunde zu der Technik machte, die wir heute noch verwenden.

Der Prozess der Sequenzierung wurde und kann durch Klonieren eines DNA-Fragments in eine bekannte Stelle in einem Plasmid unterstützt werden, das zur Unterstützung der Sequenzierung entwickelt wurde. Diese Klonierungsstelle wird von einer oder mehreren bekannten Sequenzen flankiert, die Standard-Primer verwenden können

In der Abbildung sind "A" und "B" nur Referenzpunkte auf beiden Seiten der Klonierungsstelle. Natürlich erstreckt sich das Plasmid auf beiden Seiten der gezeigten Region. Das Plasmid wird zunächst an der Klonierungsstelle aufgeschnitten (oberer Schritt) und das unbekannte DNA-Fragment einligiert (mittlerer Schritt). Dann kann die bekannte "Vorwärts"-Sequenz mit einem komplementären Primer (als Pfeil dargestellt) verwendet werden, um eine Sequenzierungsreaktion zu starten (untere Stufe, gestrichelte Linie). Zusätzliche Modifikationen umfassen (per @Chris) das Vorbereiten des Inserts mit Adaptern oder die Verwendung eines Plasmids mit einer Sequenz, die einen „umgekehrten“ Primer bindet (in dieser Abbildung wäre dies ein Pfeil auf der rechten Seite von „B“, der nach links zeigt ). Der Reverse-Primer ermöglicht die Sequenzierung des Gegenstrangs zum Forward-Primer und ermöglicht den Zugang zum 3' Ende der eingefügten unbekannten Sequenz. In den frühen Tagen der Sanger-Sequenzierung waren die Leselängen ziemlich kurz und konnten oft nicht die Länge eines größeren Inserts ausführen.

Sequenzierungsplasmide sind so konzipiert, dass ihre Forward- und Reverse-Primer-Bindungsstellen wahrscheinlich keine Sequenzen enthalten, die im Insert gefunden werden können. Da diese bekannten Primer auf diese Weise verwendet werden können, um fast jedes Insert zu sequenzieren, werden sie oft als universelle Primer bezeichnet (per @AlanBoyd).