Wie funktioniert die Hitzeschock-Transformation?

Was genau passiert, wenn kompetente Zellen wie DH5ɑ mit vorhandener DNA einem Hitzeschock unterzogen werden? Wie kommt die DNA in die Zellen?

Insbesondere, warum sind all die Schritte notwendig? Was ist, wenn Sie direkt nach dem Hinzufügen von DNA einen Hitzeschock bekommen? Was ist, wenn Sie nach einem Hitzeschock nicht auf Eis legen? Was bewirkt das Calciumchlorid? Was passiert eigentlich, wenn Zellen „kompetent“ sind? Was bestimmt die Transformationseffizienz (abgesehen von offensichtlichen Dingen wie der Menge an DNA oder Zellen)?

Um zu verdeutlichen, wovon ich spreche, verwende ich ein Protokoll wie das folgende:

1. Nehmen Sie die Zellen aus -80 ° C und tauen Sie sie 5 Minuten lang auf Eis auf.
2. Fügen Sie 1 ul (~500 ng) Plasmid-DNA zu 50 ul Zellen hinzu, mischen Sie vorsichtig mit der Pipettenspitze.
3. 30 min auf Eis lassen.
4. 45 Sek. in 42C Wasserbad geben.
5. 10 min auf Eis stellen.
6. Füge 950 ul LB hinzu, stelle 1 Stunde lang auf 37°C.
7. 300 µl der Kultur auf LB-Agarplatten mit entsprechender Selektion ausstreichen.

Ich bekomme normalerweise Tausende von Kolonien daraus (tatsächlich ist oft eine Verdünnung von 1:10 oder 1:100 erforderlich, damit ich tatsächlich isolierte Kolonien bekommen kann). Selbst wenn ich den Auswuchs überspringe, bekomme ich immer noch Hunderte.

Ich habe nicht mein kompetentes Zellprotokoll, aber im Grunde verwende ich das eine Rubidiumchlorid, das jeder verwendet: DH5ɑ-Zellen werden mit einigen Puffern gewaschen, in einer Lösung mit CaCl2 und RbCl suspendiert und dann in flüssigem Stickstoff eingefroren. Ich habe nie wirklich gemessen, aber normalerweise ist die Konzentration der Zellen in den gefrorenen Aliquots etwa 10-mal so hoch wie bei einer Flüssigkultur über Nacht (sie werden heruntergeschleudert und in einem kleinen Volumen resuspendiert).