Unterschied zwischen strangspezifischen und nicht strangspezifischen RNA-seq-Daten

Ich möchte nach dem Unterschied zwischen strangspezifischen und nicht strangspezifischen Datensätzen fragen.

Strangspezifische Daten bedeuten meines Wissens, dass wir wissen, von welchem ​​Strang das Transkript stammt.

Ich habe keinen biologischen Hintergrund. Bitte bestätigen Sie, ob es richtig ist. Wenn wir ein Transkript haben, das vom Sense-Strang stammt, wenn RNA-seq Reads produziert, wird zuerst die cDNA synthetisiert. Dann wird diese cDNA für die PCR verwendet, um die Probe zu amplifizieren? Dann könnten die generierten Reads von beiden Strängen der ursprünglichen DNA stammen?

Was ist bei strangspezifischen Protokollen anders?

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Nachverfolgen.

Bitte korrigieren Sie mich, wenn ich falsch liege. Es gibt mehrere Protokolle zur Herstellung strangspezifischer RNA-Seq-Bibliotheken. Der grundlegende Prozess ist wie folgt:

  1. Holen Sie sich die RNA;
  2. Holen Sie sich seine cDNA;
  3. Markieren Sie die cDNA irgendwie als Sense oder Antisense beim Amplifizieren (PCR?) (hier kommen die Unterschiede zwischen verschiedenen Protokollen);
  4. Dann ENTFERNEN Sie alle Antisense- (oder Sense-) cDNAs;
  5. Lesen Sie die Lesevorgänge aus der sauberen cDNA-Bibliothek.

Das Ergebnis ist, dass die Lesevorgänge von dieser RNA verwendet werden können, um die Sense-cDNA zusammenzusetzen. Und für nicht strangspezifische Bibliotheken wäre die Verwendung der Reads in der Lage, sowohl die Antisense- als auch die Sense-cDNA zusammenzusetzen.

Liege ich mit diesem Problem richtig? Vielen Dank.

Kreuzpost (zuerst geschlossen, dann wieder geöffnet...) biostars.org/post/show/43507/…

Antworten (1)

Es kann sich lohnen, das Papier „ Umfassende vergleichende Analyse von Strang-spezifischen RNA-Sequenzierungsmethoden “ zu lesen.

Die gebräuchlichsten Techniken ligieren nacheinander verschiedene RNA-Adapter an die 5'- und 3'-Enden jedes RNA-Moleküls vor der cDNA-Synthese. Am Ende erhalten Sie ein RNA-Molekül, das so aussieht (wobei A und B die beiden Adapter sind):

  5'-AAAAAA---------------BBBBBB-3'

Diese Adaptoren werden dann für die cDNA-Synthese und Bibliotheksherstellung verwendet. Da schließlich jeder Adapter an ein spezifisches Ende der RNA ligiert ist, kann die Bibliothek standspezifisch erzeugt werden; dh. Die vom Antisense-Strang abgeleiteten Reads sollten sich am Antisense-Strang des Genoms ausrichten.

** Beachten Sie, dass es andere Variationen dieser Technik gibt, aber das Protokoll von Illumina ist eines der beliebtesten.

Danke, @GWW. Bedeutet das, dass Illumina den Benutzern zwei Bibliotheken (eine Antisense- und eine Sense-Bibliothek) zur Verfügung stellen wird? Oder markieren sie einfach jedes Gelesene, aus welchem ​​Sinn es stammt? Haben Kunden beim Auslesen vorher die Adapter entfernt? Oder Benutzer müssen selbst entfernen?
Übrigens habe ich das Papier überprüft ... Kann aber zur Nachbearbeitung der Daten nicht viel finden ...
Sie meinen, die Lesevorgänge auszurichten?
Ich meine, Sie sagten, "die vom Antisense-Strang abgeleiteten Lesevorgänge sollten sich am Antisense-Strang des Genoms ausrichten", also was würde Illumina bieten? Wenn sie nur alles liefern, was gelesen wird, ist das nicht strangspezifisch, oder? Sie müssen Sense- oder Antisense-Reads herausfiltern, oder sie können jeden Read so markieren, ob er von einem Sense- oder Antisense-Strang stammt. Habe ich recht?
Nein, nach dem Alignment sollten die vom Antisense-Strang abgeleiteten Reads nur am Antisense-Strang des Genoms ausgerichtet werden (dasselbe gilt für Reads vom Sense-Strang). Mit einer Standard-RNA-seq-Präparation könnten sich Reads an beiden Strängen ausrichten, was Sie daran hindert, auf den tatsächlichen Strang zu schließen, von dem der Read abgeleitet ist.
Danke für deine Geduld, @GWW. Ja, die Reads vom Antisense-Strang sollten an der Antisense-DNA ausgerichtet sein. Bei einem Read wissen wir also, dass dieser Read aus welchem ​​Strang stammen SOLLTE, richtig?
Ja, vorausgesetzt, die Bibliotheken wurden mit einer gerichteten Bibliothek erstellt.
Unterschied zwischen strangspezifischen und nicht strangspezifischen RNA-seq-Daten
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