Beeinflusst der pH-Wert die Michaelis-Konstante?

Ich habe versucht, den Km eines Substrats zu bestätigen (der 34 +/- 4 mM beträgt). Dieser Wert wurde in 50 mM MOPS, pH 6,3 erhalten. Ich führte meinen Kinetik-Assay in einem Puffer mit pH 7 durch und erhielt einen Km-Wert von 21,5. Gemäß dieser Veröffentlichung , Abb. 2C, beträgt die normalisierte spezifische Aktivität des Enzyms etwa 70 % bei pH 6,3 und etwa 47 % bei pH 7. Wenn ich 34 mM bei pH 6,3 durch 0,7 dividiere (was mir den optimalen Km bei den optimalen pH-Wert von 5,5) und dann mit 0,48 multiplizieren, dann erhalte ich 23 mM. Auf dem Papier steht jedoch, dass Km zwischen 30 und 38 mM liegt. Wenn ich also 30 und 38 getrennt durch 0,7 dividiere und mit 0,47 multipliziere, erhalte ich 20 bzw. 25,6 mM. Da mein Wert in diesem Bereich liegt, muss dies bedeuten, dass ich das richtige Enzym und das gleiche Ergebnis wie das Papier habe.

Also meine Fragen sind:

  1. Wenn das Papier sagt, dass Km "34 +/- 4 mM" ist, kann ich davon ausgehen, dass das bedeutet, dass der Km irgendwo zwischen 30 - 38 mM liegen kann? Ich bin überrascht, wie breit die Bandbreite ist. Ich bin davon ausgegangen, dass Km normalerweise nur ein Wert mit einer Abweichung von höchstens 0,1 ist.

  2. Ändert der pH-Wert die Km-Werte? Ich verstehe, dass der pH-Wert die Form(en) des Enzyms und/oder Substrats verändert. Daher muss das beeinflussen, wie viel es an das Substrat binden möchte. Wenn der Wunsch des Enzyms, an ein Substrat zu binden, beispielsweise aufgrund eines Anstiegs des pH-Werts abnimmt, würde dies bedeuten, dass mehr Substrate benötigt werden, um das Enzym zu umgeben, wodurch Km erhöht wird.

  3. Wenn der pH-Wert den Km ändert, bestimme ich so den Km-Wert eines anderen pH-Werts, wenn der Km-Wert bei einem anderen pH-Wert bereits bekannt ist? Ich weiß, dass spezifische Aktivität und Michaelis-Konstante unterschiedlich sind, aber wie viel Produkt pro Minute umgewandelt werden kann, hängt davon ab, wie gerne das Enzym an ein Substrat bindet, was durch die Michaelis-Konstante dargestellt wird. Sind meine Überlegungen und Berechnungen zum richtigen Schluss gekommen? Wenn nein, wie erfolgt die Berechnung?

Eine sehr kurze Antwort ist ja, pH-Werte beeinflussen fast immer die Enzymeffizienz. Ein Beispiel sind lysosomale Enzyme, die in der sauren Umgebung des Lysosoms optimal aktiv sind, aber bei dem nahezu neutralen pH-Wert des Zytosols unwirksam sind. Dies schützt die Zelle, falls ein Lysosom platzen sollte; die Enzyme werden die Zelle selbst nicht verdauen. Aus dem Wikipedia-Artikel "Der Wert von K_\mathrm{M} ist sowohl vom Enzym als auch vom Substrat sowie von Bedingungen wie Temperatur und pH-Wert abhängig." . Und versuchen Sie, Maud Menten nicht zu vergessen.
Danke für deine Antwort. Aber gibt es eine Gleichung oder Methode, um die Beziehung zwischen Km und pH zu berechnen? Wenn nicht, war meine Berechnung gültig? Ich möchte überprüfen, dass, wenn pH = 6,3 und Km = 34, Km bei pH 7 gleich zwanzig sein muss.
@wswr Nein, diese Annahme ist nicht gültig, da die Beziehung zwischen Km und pH nicht linear sein und zwischen verschiedenen Enzymen variieren kann.
Eigentlich jetzt, wo ich darüber nachdenke: Ich habe Michaelis-Menten-Konstante mit spezifischer Aktivität verwechselt. Meine Berechnung war ungültig. Bei pH 6,3 ist die spezifische Aktivität hoch und der Km-Wert ist 34. Der Km, den ich bei pH erhalten habe, ist 21,5, aber laut der Veröffentlichung ist die spezifische Aktivität bei pH 7 niedriger, was bedeutet, dass der Km höher sein sollte. Kann davon ausgegangen werden, dass je höher Km, desto geringer die spezifische Aktivität und umgekehrt?
Dieses Papier könnte Ihnen helfen: Aktuelle IUBMB-Empfehlungen zur Enzymnomenklatur und -kinetik

Antworten (1)

Aus der Ableitung der Michaelis-Menten-Kinetik können Sie Folgendes erkennen:

K m = k f + k c a t k r

Wo k f und k r Bindungs- und Entbindungsgeschwindigkeitskonstanten (für die Enzym-Substrat-Bindung) bzw. und k c a t ist die Umsatzzahl. Dies gilt für die Quasi-Steady-State-Approximation (QSSA). Für die Gleichgewichtsnäherung:

K m = k f k r
was der Assoziationskonstante entspricht.

In beiden Fällen kann der pH-Wert die Bindungs- und Entbindungsrate beeinflussen, indem er die Affinität zwischen dem Enzym und dem Substrat beeinflusst. Nehmen wir zum Beispiel an, dass die Substratbindungsstelle negativ geladen ist. Ein niedriger pH-Wert würde das elektrostatische Potential der Substratbindungsstelle gegen Null erhöhen, indem die Ionisierung der funktionellen Gruppen beeinflusst wird.

Der pH-Wert kann auch indirekte Auswirkungen auf die Substratbindungsstelle haben, da er die Gesamtstruktur des Proteins modifizieren kann.

Viele enzymkatalysierte Reaktionen beinhalten eine Säure-Base-Katalyse, dh es findet ein Protonentransfer statt. Bei Reaktionen wie diesen kann sich der pH-Wert auswirken k c a t .

Wenn der pH-Wert den Km ändert, bestimme ich so den Km-Wert eines anderen pH-Werts, wenn der Km-Wert bei einem anderen pH-Wert bereits bekannt ist?

Sie können dies tun, indem Sie ein Lineweaver-Burk-Diagramm für den geänderten pH-Wert erstellen.

Ich habe ein Lineweaver-Burk-Diagramm erstellt, um den Km-Wert von 21,5 bei pH 7 zu erhalten. Aber da der einzige Km-Wert, den ich vergleichen kann, um die Enzymaktivität zu verifizieren, bei dem anderen pH-Wert von 6,3 liegt, möchte ich wissen, ob es einen anderen Weg gibt um zu sehen, ob mein Ergebnis richtig ist.
@wswr Erstellen Sie ein LB-Diagramm für pH 6,3 und vergleichen Sie es dann. Wenn Ihre Messungen genau durchgeführt werden, sollte Ihr Ergebnis korrekt sein. Ergebnis ist, was Sie beobachten; Es gibt also keine Frage von richtig oder falsch. Leider gibt es keine einfache Beziehung zwischen Km und pH. Sie können eine LB-Analyse bei unterschiedlichen pH-Werten durchführen und versuchen, durch Regression eine Beziehung zu finden. Aber dies würde nur für Ihr Enzym gelten.
In einem pedantischen Ton würde "Entbinden" idiomatisch als Dissoziation bezeichnet werden.
Ich habe gerade bemerkt, ist Km nicht = (kr + kcat) / kf = Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante: Assoziationsgeschwindigkeitskonstante?
@wswr kr ist die Dissoziationsratenkonstante. kcat ist die Umsatzzahl oder die Geschwindigkeitskonstante der Produktbildung. Beides verringert die Konzentration des [ES]-Komplexes.
Beeinflusst der pH-Wert die Michaelis-Konstante?
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