Gerichtete Evolution: Punktmutation vs. Insertion-Deletion vs. Shuffling

Im Allgemeinen werden während der gerichteten Evolution Punktmutationen in die interessierenden Proteine ​​eingeführt. Dies können spezifische Mutationen im aktiven Zentrum eines Enzyms sein, wenn Sie beispielsweise dessen Spezifität für ein neues Substrat ändern möchten. Die Punktmutationen können mit Primern eingeführt werden, wenn Sie Ihr interessierendes Gen amplifizieren. Wenn Sie jedoch nicht genau wissen, welche Änderungen vorzunehmen sind, dann ja, eine Möglichkeit, Mutationen zu erzeugen, ist die fehleranfällige PCR oder die Quick-Change-PCR. Wenn Sie sehen möchten, ob eine bestimmte Aminosäureänderung Aktivität/Stabilität/usw. aufhebt, würden Sie Alanine-Scanning durchführen ( https://en.wikipedia.org/wiki/Alanine_scanning ).

Ich habe noch nicht viel über die Einführung von Deletionen oder Insertionen für die gerichtete Evolution gehört. Erstens müssen sie im Rahmen sein, damit sich die gesamte Codierungssequenz nicht ändert. Menschen führen normalerweise aus zwei Gründen Epitop-Tags am N- oder C-Terminus ein: 1) um die Proteine ​​zu reinigen; 2) um seine Löslichkeit zu erhöhen. Aber im Allgemeinen führt die Einführung einer Deletion zu unvorhersehbaren Änderungen an der 3D-Struktur des interessierenden Proteins.

Das DNA-Shuffling wird sehr oft für die gerichtete Evolution verwendet. Hier ist eine Abbildung aus einem Nature-Artikel [1] , die das DNA-Shuffling beschreibt. Die Art und Weise, wie es normalerweise durchgeführt wird, ist die Verwendung von Sequenzhomologen des interessierenden Proteins. Die unterschiedlichen Fragmente können durch PCR-Amplifikation und Einführung kurzer Überlappungen mit den benachbarten Fragmenten erhalten werden. Die Fragmente können dann durch verschiedene Verfahren zusammengesetzt werden, einschließlich Gibson-Zusammenbau und homologe Hefe-Rekombination. Der Vorteil des DNA-Shufflings gegenüber der Einführung einzelner Mutationen besteht darin, dass weniger Mutanten gescreent werden müssen und die Aktivität/Stabilität des Proteins um ein Hundertfaches verbessert werden könnte.

DNA-Shuffling-Figur aus [1]

Interessanterweise ein DNA-Shuffling mit einer Methode namens SCHEMA [2]wurde im Labor von Chris Voigt entwickelt. Kurz gesagt, SHEMA ist ein Computeralgorithmus, der verwendet wird, um die Fragmente von Proteinen oder Schemata zu identifizieren, die rekombiniert werden können, ohne die Integrität der dreidimensionalen Struktur zu stören. Es basiert auf der 3D-Struktur (eines der Elternteile) und einem Alignment der Elternsequenzen. Es berechnet die Wechselwirkungen zwischen Resten und bestimmt die Anzahl der Wechselwirkungen, die bei der Bildung eines Hybridproteins gestört werden. Ein Fenster von Resten w wird definiert und die Anzahl interner Wechselwirkungen innerhalb dieses Fensters wird gezählt. Das Fenster wird verschoben und das Schemaprofil erstellt. Zum Beispiel. In der Abbildung unten beträgt die Anzahl der Interaktionen, die in den möglichen Chimären unterbrochen werden, 0 für die rechte Chimäre und 3 für die linke Chimäre. Die richtige Chimäre wird beim Screening verwendet.

SHEMA-Methode aus [2]