Ist die EC50 eines aktivierenden Proteins für ein Enzym ein guter Indikator für die Bindungsaffinität Kd?

Sie können sicherlich massive Unterschiede zwischen EC ₅₀ und Affinität feststellen. Dies gilt insbesondere für zellbasierte Assays und Membranproteinsysteme.

Der Grund dafür liegt darin, dass die geeigneten Zeitskalen zum Erreichen des Bindungsgleichgewichts (Stunden für nM-Affinität, Tage für pikomolare, feptomolare Affinität gemäß den Berechnungen auf der Rückseite des Umschlags) von den geeigneten Zeitskalen für Aktivierung, Endozytose, Abbau usw. Darüber hinaus können Sie Aviditätseffekte haben, die in einem Test mit verdünnter Membran im Vergleich zu einer Zelloberfläche nicht offensichtlich wären. Es könnte durchaus sein, dass sich die vorherrschenden Begriffe im Massentransport je nach Geometrie und Antigendichte ändern, und obwohl ich mir bei Vesikel vs. Emulsionen nicht ganz sicher bin, trifft dies auf Krebsmodelle zu. Theoretische Analyse des Antikörper-Targeting von Tumor-Sphäroiden: Bedeutung der Dosierung für die Penetration und Affinität für die Retention.

Fallstudie Nr. I: hGH:hGHR-Wechselwirkungen wurden ausführlich untersucht und es wurde hGH mit hoher Affinität produziert. Keine der Varianten zeigte jedoch einen verbesserten EC ₅₀ . Es stellt sich heraus, dass die Bindung hauptsächlich durch die so langsamen Off-Raten beeinflusst wurde, dass die Beeinflussung dieser Werte wenig zur Kinetik des Systems beitrug. Die Bindungsaffinität des Wachstumshormons für seinen Rezeptor übertrifft die Anforderungen für die Zellaktivität

Fallstudie Nr. II: CEA-Antikörper wurden affinitätsgereift, um eine pM-Aktivität im Vergleich zur nM-Affinität des Wildtyps aufzuweisen. Der Antikörper hatte jedoch eine minimale Wirkung auf die Tumoraufnahme. Da CEA in der Größenordnung von 30 Minuten endozytiert wird, wurde der gesamte Antikörper einfach endozytiert, anstatt als Inhibitor zu wirken. Gerichtete Evolution eines anti-carcinoembryonalen Antigens scFv mit einer 4-tägigen monovalenten Dissoziationshalbwertszeit bei 37°C .

(Bearbeiten) Mir wurde klar, dass diese Antwort eher für IC ₅₀ s als für die oben beschriebenen EC ₅₀ -Experimente gilt. Viele der Punkte bleiben jedoch bestehen. Der Km zwischen einem Substrat und seinem Enzym ist eine thermodynamische Eigenschaft, wobei der EC ₅₀ auch dynamische Faktoren aufweist, die seine Messung beeinflussen können.

Ich möchte auch hinzufügen, dass eine einfache Anpassung der pH-2-Einheiten zu einer Aktivitätsänderung von 2 Größenordnungen führen kann.

(edit2) Ein weiterer Punkt zu enzymatischen Assays ist, dass aus einer Beobachtung der Michaelis-Menten-Kinetik die K _M der Reaktion nicht die K _D des Enzyms ist, sondern alternativ die effektive Bindungskonstante.

Erinnere dich daran:

Wenn es ein nicht-triviales k _cat gibt , das mit der Dissoziationsrate k _r vergleichbar ist , wird das Enzym eine effektive halbmaximale Konzentration haben, die signifikant höher ist als K _d . Es gibt mehrere Möglichkeiten, wie Ihr Assay zu den angezeigten Diskrepanzen führen kann. Das erste wäre Ihre Strategie zur Messung Ihres EC ₅₀ . Wenn das eine ein enzymatisches Auslesen und das andere ein bindendes Auslesen ist, würden Sie natürlich sehr unterschiedliche Ergebnisse erhalten. Alternativ kann das Enzym im Detergenssystem katalytisch aktiver sein als das Vesikelsystem, was zu einer höheren effektiven K _M führt . Nochmal zum pH-Wert.

Schließlich gibt es immer wieder diesen peinlichen Moment, in dem einem klar wird, dass man vielleicht aus Versehen eine Titrationskurve statt einer Bindungskurve gemessen hat.

Im Folgenden werde ich versuchen, Ihre Frage anhand eines konkreten Beispiels einer (kompetitiven) reversiblen Aktivierung zu beantworten, und ich hoffe zu zeigen, was für ein irreführender Parameter EC ₅₀ sein kann. (Die Ableitung des Zinsgesetzes ist ein Interessengebiet, daher die langatmige Antwort).

Es kann natürlich Informationen liefern, aber meiner Meinung nach muss es mit äußerster Sorgfalt verwendet werden.

Ich beschränke meine Kommentare auf den Fall, wo A ein reversibler Aktivator ist und wo [A] >> e _o und [S] >> e _o . (Alle Konstanten sind unten definiert).

Kurz gesagt, ich behandle keine irreversible Aktivierung und ich behandle nicht den Fall, in dem A als fest bindender Aktivator betrachtet wird (sodass [A] ≈ e _o ). Mit anderen Worten, ich mache die Steady-State-Approximation ( Briggs & Haldane , 1925)

Betrachten Sie den folgenden einfachen Mechanismus zur Aktivierung in einem Enzym mit einem einzigen Substrat:

Ein Mechanismus für kompetitive, reversible Aktivierung

Ohne Anwesenheit des Aktivators (A) kann das Substrat (S) nicht an das freie Enzym (E) binden. Das heißt, nur der Aktivator kann (reversibel) an E binden, und das Substrat bindet (reversibel) an den EA-Komplex. Die Reaktion erfolgt innerhalb des EAS-Komplexes (was EAP ergibt). Die Dissoziation von Produkt (P) von EAP ergibt EA.

Das (stationäre) Anfangsratengesetz für den obigen Mechanismus lautet wie folgt:

Wie angegeben, sind alle Konstanten unten definiert und folgen den üblichen Definitionen in der Enzymkinetik. Ich nenne hier nur eine: K _A ist die Dissoziationskonstante für den Aktivator und hat Konzentrationseinheiten.

Ich habe diese Gleichungen unter Verwendung einer computergestützten Version der King & Altman-Methode ( King & Altman , 1956) abgeleitet, aber es ist nicht schwierig, dies zu tun. Es war reine Faulheit, die eine Ableitung der „ersten Prinzipien“ verhinderte. Die Ableitung von Geschwindigkeitsgesetzen wird in den meisten Büchern über Enzymkinetik ausführlich behandelt, und gute Berichte finden sich in Segel (1975) und Cornish-Bowden (2004).

Man kann nun die folgenden Punkte machen

• Es gibt keine Aktivität ohne A (wie man erwarten würde).
• Wenn [A] >> K _A , wird das Geschwindigkeitsgesetz identisch mit der Michaelis-Menten-Gleichung (wie man erwarten würde).
• Die Gleichung ähnelt dem Fall der kompetitiven Hemmung , aber (beachten Sie die subtile Änderung) mit (1 +  K _A  / [A]) anstelle von (1 + [I] /  K _i )
• Man kann diesen Mechanismus als Beispiel für eine Wettbewerbsaktivierung betrachten

Definieren

• ν _i ^exc     = die Anfangsgeschwindigkeit, wenn A in großem Überschuss ist [ dh Setzen von [A] gleich ∞ in Gleichung (1)].
• EC ₅₀     = die Konzentration von A, die ν _i gleich ν _i ^exc / 2 ergibt (halbmaximale Aktivierung)

erlaubt die Ableitung der beiden folgenden Gleichungen:

Setzt man die linke Seite des Obigen gleich 2 und löst nach [A] auf, erhält man die folgende äußerst wichtige Gleichung

Man kann nun folgende Schlüsse ziehen

• Wenn [S] = K ^S _m

  

  Mit anderen Worten, wenn das Substrat in einer Konzentration vorhanden ist, die gleich der Michaelis-Konstante ist, ist der Wert von EC ₅₀ halb so groß wie der Wert von K _A !.

• Wenn [S] >> K ^S _m

  

  Wenn zum Beispiel [S] = 10 x K ^S _m ist, ist EC ₅₀ ein Zehntel des Wertes von K _A , und wenn [S] = 100 x K ^S _m ist, ist die Zahl ein Hundertstel.

• Wenn [S] << K ^S _m

  

Somit ergibt EC ₅₀ für einen kompetitiven Aktivator nur dann, wenn [S] << K ^S _m eine vernünftige Schätzung von K _A ist .

Die Substratkonzentration in einem „normalen“ Enzymassay wird wahrscheinlich gleich oder größer als die Michaelis-Konstante sein (um Aktivität zu „sehen“), und somit wird EC ₅₀ eine Unterschätzung von K _A sein .

Wenn das Substrat in einer „sättigenden“ Konzentration vorhanden ist (z. B. 10 x K ^S _m ), dann ist man in echten Schwierigkeiten.

Dies ist jedoch nicht die einzige Überlegung. Die Art und Weise, in der EC ₅₀ von [Substrat] abhängt, hängt nicht nur von der Substratkonzentration ab, sondern auch vom Mechanismus .

Wie nachstehend kurz diskutiert, ist der Fall der kompetitiven Aktivierung analog zu dem der kompetitiven Hemmung. Für nicht- kompetitive Hemmung ist die K _i (Hemmkonstante) jedoch nur gleich IC ₅₀ (die Konzentration des Inhibitors, die eine halbmaximale Hemmung ergibt) bei hoher Substratkonzentration ! (siehe Naqui , 1982). Analog kann man schlussfolgern, dass dies auch für die nicht kompetitive Aktivierung gilt.

Es ist sehr schwer zu erkennen, wie EC ₅₀ von praktischem Nutzen sein kann, außer vielleicht, wenn der Aktivierungsmechanismus bekannt ist. Zumindest Schlussfolgerungen aus EC ₅₀ -Daten sollten ansonsten nicht als endgültig angesehen werden.

Außerdem habe ich nur den Fall einer Ein-Substrat-Reaktion diskutiert. Zwei-Substrat-Reaktionen haben das Potenzial für noch größere Komplexität.

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Illustratives Beispiel (Konkurrierende Aktivierung)

Nehmen wir ein Beispiel und prüfen einige Schlussfolgerungen:

• k ^f _cat    = 1000 s ^-1
• eo ₌    1
• K ^S _m    = 10 u M
• KA =      50 _uM _

Es kann berechnet werden, dass:

• Wenn [S] gleich 10 &mgr ; M ist (dh wenn [S] gleich K ^S _m ist ) und wenn [A] „gesättigt“ ist (aus Gründen des gleich ∞ gesetzten Arguments), beträgt die Geschwindigkeit 500 & mgr ; M s ^–1 [aus Gl. (1) ].

  Aus Gleichung (2) ergibt sich, dass die zum Erreichen der Hälfte dieses Wertes (halbmaximale Aktivierung) erforderliche Konzentration von A 25 µM beträgt (EC ₅₀ entspricht 25 µM ) .

  Dieser Wert kann direkt aus Gleichung (3) berechnet werden.

• Wenn [S] gleich 100 &mgr ; M ist (dh [S] gleich 10 × K ^S _m ) und wenn [A] „gesättigt“ ist, beträgt die Geschwindigkeit nun 909  & mgr ; M s ^–1 [aus Gleichung (1) ].

  Aus Gleichung (2) ergibt sich, dass die zum Erreichen der Hälfte dieses Wertes erforderliche Konzentration von A jetzt nur noch ~4,5 µM beträgt

  Dieser Wert kann direkt aus Gleichung (3) berechnet werden [EC ₅₀ entspricht (50 / 11) µ M]

• Wenn [S] gleich 1 µM ist (dh [S] gleich einem Zehntel der Michaelis-Konstante) und wenn [A] "gesättigt" ist, beträgt die Geschwindigkeit jetzt nur ~91 µM s ^-1 [aus Gleichung (1)] .

  Aus Gleichung (2) ergibt sich, dass die Konzentration von A, die erforderlich ist, um die Hälfte dieses Werts zu erreichen, ~45,5 µM beträgt (jetzt fast gleich K _A )

  Dieser Wert kann direkt aus Gleichung (3) berechnet werden [EC ₅₀ entspricht (500 / 11) µ M]

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Reversible Hemmung & IC ₅₀ . Ein kurzer Kommentar

In keinem der oben genannten Punkte gibt es viel Neues. Auf dem Gebiet der Enzymhemmung sind die Unzulänglichkeiten von IC ₅₀ (die Konzentration des Inhibitors, die 50 % Hemmung ergibt) und die Beziehung zur Hemmungskonstante bekannt [siehe zum Beispiel Chou (1974), Segel (1975), Naqui (1982) & Tsou (1987)], aber (wie mir scheint) oft ignoriert.

Das Papier von Naqui gibt eine sehr prägnante Analyse der Situation und das pdf ist für alle frei verfügbar.

Reversible Inhibitoren können abhängig vom Hemmungsmuster in vier Klassen eingeteilt werden: kompetitiv, nicht kompetitiv, nicht kompetitiv und "gemischt" (siehe Naqui , 1982, und darin enthaltene Referenzen).

In allen Fällen außer nicht-kompetitiver Hemmung ist K _i ≠ IC ₅₀ und IC ₅₀ ist substratabhängig.

(Die nicht-kompetitive Hemmung ist die „flüchtige“, bei der es einfach so ist, dass die katalytische Konstante und die Spezifitätskonstante ( k ^f _cat / K ^S _m ) im gleichen Maße geändert werden oder, anders ausgedrückt, die Steigung und Abschnitt eines Lineweaver-Burk-Plots (zufälligerweise) werden im gleichen Maße geändert)

Für einen nicht kompetitiven Inhibitor (wie angegeben) ist der IC ₅₀ nur gleich Ki bei hoher Substratkonzentration (siehe _Naqui , 1982).

Wie im Fall der kompetitiven Aktivierung ist IC ₅₀ nur bei niedrigen Substratkonzentrationen gleich Ki für einen kompetitiven Inhibitor (siehe Naqui _, 1982).

"Gemischte" Hemmung ist sogar noch komplexer, und die Hemmungskonstante kann größer oder kleiner als IC ₅₀ sein, abhängig von experimentellen Bedingungen (siehe Naqui , 1982).

Gute Frage, BTW.

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Nachtrag

Da ich die vollständige Form des Kursgesetzes (im Gegensatz zum Anfangskursgesetz) hergeleitet habe, lohnt es sich wahrscheinlich, es zu posten. Das Anfangsgeschwindigkeitsgesetz wird aus dieser Gleichung erhalten, indem [P] gleich Null gesetzt wird.

Kinetische Konstanten, definiert als Geschwindigkeitskonstanten

Geschwindigkeitskonstanten sind (als Indizes) von Spezies bis Spezies nummeriert , mit einer Nummerierung wie im Diagramm.

Somit ist die Geschwindigkeitskonstante k _1,2 diejenige von E (Spezies 1) bis EA (Spezies 2).

• Katalytische Konstanten

  

  

• Michaelis-Konstanten

  

  

• Spezifitätskonstanten

  

  

• Aktivierung (Dissoziationskonstante)

  

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Definition der Kinetikkonstante

• ν Geschwindigkeit

• ν _i    die Anfangsgeschwindigkeit

• K ^S _m    die Michaelis-Konstante für S

• K ^P _m    die Michaelis-Konstante für P

• k ^f _cat    die katalytische Konstante (in Vorwärtsrichtung )

• k ^r _cat    die katalytische Konstante (in umgekehrter Richtung)

• V _max    die maximale Geschwindigkeit, gleich k ^f _cat e _o

• e _o    die Gesamtenzymkonzentration

  

• K _A      die Dissoziationskonstante für (Aktivator), gleich k _2,1 / k _1,2 , mit Konzentrationseinheiten (z. B. Molarität) [Geschwindigkeitskonstanten sind von Art zu Art nummeriert , Nummerierung wie im Diagramm].

• ν _i ^{überschreite}    die Anfangsgeschwindigkeit, wenn A im Überschuss ist ([A] = ∞).

• EC ₅₀    die Konzentration von A, die ν _i gleich ν _i exc / 2 ergibt (halbmaximale Aktivierung)

• [A] Anfangskonzentration des Aktivators.

• [S] Die Anfangskonzentration des Substrats.

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Das Geschwindigkeitsgesetz und die Diagramme wurden mit Mathematica erhalten . Für Matematica bei SE siehe hier

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Verweise

• Briggs, GE & Haldane, JBS (1925). Eine Anmerkung zur Kinetik der Enzymwirkung. Biochem. J . 19 , 338 - 339.[ pdf ]

• Chou, TC (1974) Beziehungen zwischen Hemmungskonstanten und fraktionierter Hemmung in enzymkatalysierten Reaktionen mit unterschiedlicher Anzahl von Reaktanten, unterschiedlichen Reaktionsmechanismen und unterschiedlichen Arten und Mechanismen der Hemmung. Mol. Pharmacol ., 10 , 235–247 [ veröffentlicht ]

• Cornish-Bowden, A. (2004). Grundlagen der Enzymkinetik. 3. Aufl. Portland Press Ltd., London.

• King, EL & Altman, C. (1956). Eine schematische Methode zur Ableitung der Geschwindigkeitsgesetze für enzymkatalysierte Reaktionen. J. Phys. Chem . . 60 , 1375 - 1378. [ ACS-Website ]

• Naqui, A. (1982). Was bedeutet I50? (1983) Biochem. J . 215 , 429-430 [ pdf ]

• Segel, IH (1975). Enzymkinetik. Verhalten und Analyse von schnellen Gleichgewichts- und Steady-State-Enzymsystemen. John Wiley & Sons, Inc., New York.

• Tsou, CL (1987) Das Screening von auf Enzyme gerichteten Arzneimitteln. Bioessays , 6 , 237-238. [ veröffentlicht ]