Suche nach einer Template/Oligo-Kombination für mein erstes PCR-Experiment

Sie brauchen ein Genom, das nicht zu komplex ist, was auf etwas Mikrobielles hindeutet. Sie benötigen auch ein gut charakterisiertes Genom: entweder vollständig sequenziert oder mit vielen sequenzierten Genen, um Primer entwerfen zu können. Und schließlich braucht man eine leicht zugängliche Materialquelle für die DNA-Extraktion.

Ich würde entweder Trockenhefe als Quelle für Saccharomyces cerevisiae -DNA oder lebenden Joghurt als DNA-Quelle von Laktobazillen vorschlagen. Sie könnten sogar versuchen, etwas aus Joghurt zu kultivieren, um reine Bakterienkolonien zu erhalten: Da diese aus einer Nahrungsquelle stammen, sollte das Risiko minimal sein.

Sie könnten von einer der traditionellen pflanzlichen DNA-Quellen (z. B. Zwiebeln) in Versuchung geführt werden, aber es kann schwierig sein, die Co-Reinigung von Polysacchariden zu vermeiden, die DNA-verwandte Enzyme hemmen.

Schließlich, wenn Sie einige Bakterien kultivieren oder sogar wenn Sie Trockenhefe verwenden, müssten Sie wahrscheinlich überhaupt keine DNA präparieren. PCR direkt aus Bakterienzellen ist weit verbreitet – der 95 C-Schritt wird ausreichend DNA freisetzen.

später als Antwort auf den Kommentar von OP hinzugefügt

Ich entschied mich, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus , weil ich das immer wieder in Bezug auf Joghurt fand. Wenn Sie eine Reihe von Joghurts testen würden, könnten Sie meiner Meinung nach ziemlich sicher sein, dass dies vorhanden wäre.

Es gibt 5 veröffentlichte Genome für verschiedene Stämme der Art Lactobacillus delbrueckii , einschließlich der Unterart bulgaricus (verschiedene Stämme) und lactis . Wie unterschiedlich sind sie? Ich beschloss, mir ein Gen anzusehen, und Laktatdehydrogenase schien eine logische Wahl zu sein (es produziert die Milchsäure).

Die vollständige Nukleotidsequenz für das Laktatdehydrogenase-Gen aus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842 ist hier . Wenn Sie von dieser Seite aus einen BLAST ausführen, der die Suche auf Laktobazillen (taxid 1578) beschränkt, finden Sie tatsächlich Treffer für das Gen von mehreren anderen Genomen. Hier eine repräsentative Auswahl vom Sequenz-Alignment bis zu den am wenigsten ähnlichen Treffern:

Query  99766   CCTTCCACGCTTCTGGAGGTACTGAATTCGCCCTGGCTCAACTGGGCAACGATGCCGGTA  99825
               ||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||
Sbjct  90616   CCTTCCACGCTTCTGAAGGTACTGAATTCGCCCTGGCCCAACTGGGCAACGATGCCGGTA  90675

Query  99826   TGTACGGTGCCGTTAAGATGGTTCTGTAATTTTGAATGTAAAAAAGCACCAGGCTTTTAA  99885
               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||| |||||||
Sbjct  90676   TGTACGGTGCCGTTAAGATGGTTCTGTAATTTTGAATATAAAAAAGCACCAGACTTTTAA  90735

Query  99886   AGTCTGGTGCtttttttGTTTATCCTAAAGAGTCCAGGGTTGCCTTTATCGTCGCGGCTG  99945
               |||||||||||| |||||||||| |||||||||||||||||||||| |||||||||||||
Sbjct  90736   AGTCTGGTGCTTATTTTGTTTATTCTAAAGAGTCCAGGGTTGCCTTCATCGTCGCGGCTG  90795

Query  99946   AGGCCCGCATCTTGGCCAATTCGCTGTCATTTAACGGCAATTCCAGTACGTGGCTGATCC  100005
               ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| |
Sbjct  90796   AGGCCTGCATCTTGGCCAATTCGCTGTCATTTAACGGCAATTCCAGCACGTGGCTGATTC  90855

Query  100006  CTTGTCCGTTGATGATGGCCAGGGTGCCCAGGTAGATCTCATCCTTGATCCCGTATTCCC  100065
               |||| |||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  90856   CTTGCCCGTTGATGATGGCCAGGGTGCCCAGATAGATCTCATCCTTGATCCCGTATTCCC  90915

Query  100066  CGTGCAATGGTGCGGAAAGAGGCAGGGCCAGGTCGTTGTTTTCCAAAATGGCCGTCACGA  100125
               |||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||
Sbjct  90916   CGTGCAATGGCGCGGAAAGAGGCAGGGCCAGGTCGTTGTTTTCCAAAATGGCCGCCACGA  90975

Query  100126  TCTTGGCCAGCATCATGGCCACGCCATAGTAGGTTGCGCCCTTTTTGACGATAATCTCGC  100185
               |||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| |||| |||||||
Sbjct  90976   TCTTGGCCAGCATCATGGCCACGCCATAGTAGGTCGCGCCCTTTTTGCCGATGATCTCGC  91035

Wie Sie sehen können, gibt es einige Unterschiede, aber es sollte kein Problem geben, Primer zu entwerfen, die zu beiden passen (nochmals - dies ist nur ein Teil des Gens). Natürlich möchten Sie vielleicht ein Alignment für alle 5 Sequenzen vornehmen, aber ich hatte den Eindruck, dass zumindest einige der anderen mit der Abfrage identisch waren, obwohl sie von verschiedenen Unterarten stammen. Dies sind sehr eng verwandte Organismen.

In Bezug auf Ihr Experiment schlage ich vor, dass Sie planen, eine Reihe von Joghurts und/oder Vorspeisen als Vorlagequelle zu verwenden. Sie können sie sogar mischen, wenn Ihr Setup Einschränkungen unterliegt.

Schönes Projekt. Wie schneidet Ihre Maschine im Vergleich zu diesem Open-Source-Thermocycler ab ?

Da Sie wahrscheinlich ein paar Oligonukleotid-DNA (Primer) bestellen, würde ich ein paar weitere DNA-Oligos bestellen, die als Vorlage dienen.

Etwas wie das:

oligo 1, primer forward. 5'-AAAAAAAAAAA-3'->
oligo 2, template        3'-TTTTTTTTTTTNNNNNNN[...]NNNNNNNNNNCCCCCCCCCC-5'
oligo 3, template        5'-AAAAAAAAAAANNNNNNN[...]NNNNNNNNNNGGGGGGGGGG-3'
oligo 4, primer reverse                                <--3'-CCCCCCCCCC-5'

Dies soll Ihnen nur eine Idee geben, die tatsächlichen Sequenzen sollten länger sein, einen ähnlichen GC%-Gehalt und ein ähnliches t-Schmelzen haben. Der Vorteil ist, dass Sie die Komplexität reduzieren und praktisch auf PCR-Inhibitoren verzichten können.

Sie benötigen auch etwas DNA-Polymerase. Vielleicht können Sie sich ein Aliquot von jemandem ausleihen, der in einem Biologielabor arbeitet.

Sie werden sowieso irgendwo Primer und Enzyme bekommen. Die beste Option wäre, ein Plasmid von einem beliebigen Biolabor zu erhalten. Die meisten Plasmide haben spezifische Sequenzen wie die M13-Promotorsequenz , die T7-Terminator/Promotorsequenz usw. Dies sind Standardsequenzen, die von Viren abgeleitet sind, die üblicherweise für Primer-Bindungsstellen für die Sequenzierung verwendet werden. Außerdem sind diese Primer ziemlich standardisiert und für eine einfache PCR optimiert, und Sie können sie ganz einfach bekommen.