Während der Brückenamplifikation, wenn Sequenzen, die an Adaptern auf der Oberfläche befestigt sind, "Brücken" bilden und repliziert werden, scheint es, als würden Sequenzen erzeugt, bei denen beide Enden an der Oberfläche befestigt sind. In diesem Link in Abbildung 7 gibt es zum Beispiel Sequenzen, die auf der Platte in beide Richtungen zeigen. In Schritt 8 sind alle Sequenzen in die gleiche Richtung ausgerichtet (rosa Ende an der Oberfläche befestigt). Wie geschieht dies? Wie werden die anderen Sequenzen entfernt?
In diesem Dokument erfahren Sie, wie die Illumina-Sequenzierung funktioniert.
Wenn Sie eine Single-End-Sequenzierung durchführen, werden die nach der Brückenamplifikation + Denaturierung ( Schritt-7 ) produzierten Rückwärtsstränge spezifisch entfernt (an der Verbindungsstelle von Primer und der "Insert"-Region abgeschnitten). Darüber hinaus werden die freien 3'-Enden (durch chemische Modifikation) blockiert, um sicherzustellen, dass es kein unerwünschtes Priming gibt.
Für die Paired-End-Sequenzierung werden beide Stränge sequenziert; so wird in einer Durchflusszelle der Vorwärtsstrang gespalten, während in der anderen der Rückwärtsstrang gespalten wird.
Vermutlich haben sie einen Satz Fragmente von ihren Figuren entfernt, um die Darstellung klarer zu machen. In Wirklichkeit bleiben beide Fragmente auf dem Chip immobilisiert. Der Sequenzierungsprimer bindet nur an einen Adapter, was eine selektive Verlängerung eines der Sätze in jedem Lauf ermöglicht. Für Fragmente mit ausreichender Länge bietet dies einen einfachen Mechanismus zum Erstellen von Paired-End-Sequenz-Reads, da Sie einen Primer zum Lesen eines Strangs und anschließend einen anderen Primer zum Lesen des anderen Strangs verwenden können.