Wie finde ich ein geeignetes qRTPCR-Referenzgen für ein Experiment zur Entzündungsreaktion?

Ich habe mehrere Haushaltsgene – Hprt , β-Aktin und GAPDH – ausprobiert, um die relative Expression eines Zytokins zur Messung der entzündlichen lokalen Reaktion in Mäuseohren zu analysieren. Alle diese Haushaltsgene zeigen jedoch signifikante Unterschiede sowohl innerhalb als auch zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen.

Ich weiß wirklich nicht, wie ich das lösen soll. Ich nehme die gleiche Menge an RNA (quantifiziert durch Nanotropfen), um cDNA herzustellen, also habe ich wohl die gleiche Konzentration in allen Proben.

Irgendwelche Vorschläge, was passieren kann und wie man es löst? Könnte ich etwas anderes verwenden, um die relative Quantifizierung zu messen? (Mein interessantes Zytokin ist TNF).

Wenn Sie sagen, "[sie unterscheiden] sich signifikant voneinander", meinen Sie zwischen Wiederholungen unter denselben experimentellen Bedingungen oder zwischen Bedingungen? Es wäre nicht sinnvoll, sich auf ein haushaltsübliches Genexpressionsniveau zu normalisieren, wenn es sich zwischen den Bedingungen nicht ändert.
Sie unterscheiden sich zwischen verschiedenen Bedingungen und auch unter gleichen experimentellen Bedingungen. Ich habe die DNA-Konzentration der Proben überprüft und sie sind gleich.

Antworten (4)

Sie sagen nicht, wie Sie messen, aber ich vermute, dass Sie quantitative PCR verwenden. Ein typischer Ansatz zur Handhabung der Housekeeping-Gennormalisierung in qPCR-Experimenten ist in beschrieben

Präzise Normalisierung quantitativer Echtzeit-RT-PCR-Daten durch geometrische Mittelung mehrerer interner Kontrollgene.

Wir skizzieren eine robuste und innovative Strategie, um die am stabilsten exprimierten Kontrollgene in einem bestimmten Gewebesatz zu identifizieren und die minimale Anzahl von Genen zu bestimmen, die zur Berechnung eines zuverlässigen Normalisierungsfaktors erforderlich sind. Wir haben zehn Haushaltsgene unterschiedlicher Häufigkeit und funktioneller Klassen in verschiedenen menschlichen Geweben bewertet und gezeigt, dass die herkömmliche Verwendung eines einzelnen Gens zur Normalisierung zu relativ großen Fehlern bei einem erheblichen Anteil der getesteten Proben führt. Der geometrische Mittelwert mehrerer sorgfältig ausgewählter Haushaltsgene wurde durch die Analyse öffentlich zugänglicher Microarray-Daten als genauer Normalisierungsfaktor validiert.

Es gibt ein R-Paket namens NormqPCR , das diesen Ansatz implementiert (Veröffentlichung hier ).

Kurz gesagt erforderte der Ansatz, mehrere Haushaltsgene zu messen und iterativ diejenigen zu entfernen, die am variabelsten sind, um am Ende zwei Gene zu erhalten, die gemeinsam am wenigsten variabel sind, und daraus eine Art Pseudo-Haushaltsgen zu machen, mit dem Sie Ihre anderen Gene normalisieren können.

Dies verwandelt schlechte Daten nicht auf magische Weise in gute Daten, aber es hilft, einige intrinsische Probleme mit Housekeeping-Genen zu beseitigen.

Haushaltsgene sind nicht unbedingt konstant. Eine andere Möglichkeit, die Veränderung der Genexpression zu messen, ist RNA-seq. Es normalisiert die Zählungen gegen das gesamte Transkriptom anstatt gegen bestimmte Haushaltsgene.

Wenn es kein etabliertes robustes Protokoll gibt, können Sie Eissa et al. folgen. 2017, Wissenschaftliche Berichte . Sie standen vor dem gleichen Problem in einem anderen entzündlichen Modellsystem bei Mäusen und skizzierten eine Strategie, wie man robuste Haushaltsgene finden kann (und schrieben dann eine Veröffentlichung darüber).

Können Sie die Strategie kurz beschreiben?
Ich glaube, dass es möglicherweise mehr Schaden anrichtet, wenn Sie das gesamte Papier in einen Absatz komprimieren.
Es ist schwer zu sagen, ob OP ein Array oder eine qPCR mit sorgfältig ausgewählten Zielen durchführt. Wenn es ein Array wäre, würde ich vorschlagen, dass das OP die Gene über alle Proben hinweg nimmt, %CV berechnet und die Gene mit dem niedrigsten CV als Normalisierungsgene verwendet. Er müsste sie nur aus der Analyse ausschließen. Es ist schwieriger zu bestimmen, was Sie einzeln verwenden sollten. Vielleicht gibt es irgendwo in seinem Modell RNAseq-, Microarray- oder Nanostring-Daten, die er dafür verwenden kann.
Warum ablehnen? Die obige Antwort ist richtig. Die Veröffentlichung beschreibt ein allgemeines Protokoll zur Behandlung der OP-Frage.

Ein geeignetes Referenzgen zu finden, ist schwierig. Dies hängt von Ihren Vorkenntnissen über das System ab. Sie können mit der gleichen Menge an RNA beginnen, aber Fehler können viele andere Schritte ansammeln. Aus diesem Grund verwenden Sie ein Referenzgen, um die Auswirkungen dieser Fehler zu minimieren, die sich während der Probenverarbeitung angesammelt haben. Wenn Sie also nicht sehr genau sind, können Sie nicht sagen, dass alles konstant war und der Ausdruck die Quelle der Variation ist. Sobald Sie ein vermeintliches Referenzgen gründlich getestet haben, können Sie "glauben", dass es sich nicht ändern würde, wenn Sie das Experiment wiederholen.

Trotzdem würde ich darauf bestehen, dass eine viel bessere (und recht einfache) Methode darin besteht, einen " Spike-In " zu verwenden. Es ist eine synthetische Nukleinsäure, die Sie Ihren Proben hinzufügen. Ein ähnliches Konzept kann auch für Proteine ​​und Metaboliten verwendet werden. Sie können die gleichen Mengen der synthetischen RNA in Ihre verschiedenen RNA-Proben geben. Wenn Sie das Volumen konstant halten, wäre die Konzentration des Spike-in in verschiedenen Proben gleich. Anstelle eines Haushaltsgens würden Sie also jetzt das Spike-In als Referenz verwenden. Spike-in s haben sich sogar für Einzelzell-RNAseq-Studien als zuverlässig erwiesen ( Lun et al., 2017 ).

Wie finde ich ein geeignetes qRTPCR-Referenzgen für ein Experiment zur Entzündungsreaktion?
AntwortenHierDatenschutz-Bestimmungen1y, 0v