Wie interagiert Cas9 mit CRISPR?

Ich habe gelesen, dass das Cas9-Protein zusammen mit geführter RNA an ein spezifisches DNA-Fragment eines Fremdorganismus bindet, das in die DNA eines Wirtsorganismus integriert ist. Um den Wirt gegen eine Virusinfektion immun zu machen, heftet sich Cas9 zusammen mit gRNA, die komplementär zu viraler DNA ist, an die Wirts-DNA, indem es sie löst, und schneidet dann die DNA an dieser Stelle, wodurch die virale DNA entfernt wird. Der Wirt kann also nur das Virus entfernen, das zum zweiten Mal eindringt, da er aus dem ersten darin integrierten Virus eine komplementäre RNA herstellt und das Virus nicht vollständig entfernen kann.

  1. Ist der Prozess, den ich denke, richtig?
  2. Und können wir Cas9 verwenden, um die DNA an jeder Stelle unserer Wahl zu schneiden?
Fragen Sie nach CRISPR/Cas9-Bearbeitungssystemen, die Sie im Labor zur Rekombination von DNA verwenden würden, oder interessieren Sie sich tatsächlich für die bakterielle adaptive Immunität? Die in einer Laborumgebung verwendeten Cas9-Systeme sind konstruiert und verhalten sich etwas anders als das, was endogen in Bakterien gefunden wird.

Antworten (1)

Wir verwenden derzeit CRISPR im Labor, um Zellen zu modifizieren. Wie @AMR sagte, wurde es vom In-vivo- Immunsystem modifiziert, um im Labor im Bereich der DNA-Bearbeitung verwendet zu werden. Die Addgene-Website bietet sowohl einen historischen Hintergrund als auch einen Anwendungsleitfaden , die sehr gut gemacht sind. Um Ihre Fragen zu beantworten:

  1. Das Bakterium ( S. pyogenes , S. aureus usw.) integriert einen Teil der viralen DNA (Protospacer) in sein Genom, flankiert von Repeats. Bei der Transkription leitet die von dieser neu kombinierten Sequenz abgeleitete RNA das Cas9-Protein zur viralen DNA, die komplementär ist. Ein weiteres erforderliches Element ist das PAM (Protospacer Associated Motiv), das sich direkt neben dem Protospacer auf der viralen DNA befindet. Indem es nicht auf der bakteriellen DNA ist, stellt es sicher, dass das Cas9 nicht seine eigene DNA schneidet.
  2. Die einzigen Einschränkungen sind das PAM und die Off-Targets. Das PAM ist für jede Spezies spezifisch (z. B. S. pyogenes ist NGG). Einige Sequenzen können im Genom eines Organismus wiederholt werden, was bedeutet, dass, wenn Sie eine Sequenz finden, die zu einem Schnitt an einer gewünschten Stelle führen würde, diese auch an anderer Stelle schneiden könnte. Das würde die Führungssequenz zu einer schlechten Wahl machen.
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