Einspleißen mit CRISPR/Cas

Ich muss ein Gen mit der höchstmöglichen Rate in ein menschliches Zellgenom spleißen. Ich meine, es spielt keine Rolle, wo das Gen eintritt, noch spielt es eine Rolle, ob einige Zellen dadurch sterben.

CRISPR kennt Knock-in-Gene mit sehr hoher Spezifität, dies reduziert die Erfolgsrate, wenn wir eine geringe Menge an gRNA und/oder des Proteins haben.

Ich muss das Gen einfügen, ohne auf einen bestimmten Ort zielen zu müssen.

Ist das irgendwie mit CRISPR möglich?

Ich weiß, dass es dafür möglicherweise eine bessere Technik gibt, aber ich kann nur CRISPR verwenden.

Gibt es eine gute Möglichkeit, das Genprodukt in einer lebenden Zelle nachzuweisen? Weil Sie die Zellen einfach nach FACS sortieren und die Zellen nehmen könnten, die den Knock-In haben, und diese dann züchten.
Könnten Sie bitte definieren, was die Frage eigentlich ist? Wenn es "können Sie CRIPR/Cas9 verwenden, um ein Gen in ein Genom einzufügen?" Ja, du kannst.
@cagliari2005, Die Frage ist, ist es möglich, mit Crispr ein Gen mit hoher Erfolgsrate einzufügen, wenn ich sehr geringe Mengen Crispr in der Zelle habe? Ich meine, ich muss sein High gezielt reduzieren - um höhere Raten zu bekommen. Ist es möglich ?
Was die Spezifität und Spaltungseffizienz bestimmt, ist die Leit-RNA. Da Sie darauf nicht reagieren können, kenne ich persönlich keine Tricks für so etwas wie Zellkulturbedingungen, die das tun würden, was Sie wollen.
Vielleicht könnten Sie sich Bedingungen ansehen, die die homologe Rekombinationsrate erhöhen.
Die Verwendung einer chemisch modifizierten Leit-RNA mit höherem Schmelzpunkt könnte bei der Insertionsrate helfen, aber ich vermute, dass dies auch die Spezifität verringern würde.
Verringern Sie die Spezifität - das ist es, was ich brauche, weil es die Einfügungsrate erhöht. Aber können Sie mehr über den Schmelzpunkt von gRNA sagen?
Ich bin kein Experte für Modifikationen des RNA-Rückgrats, aber ich habe gelesen, dass Locked Nucleic Acids oder ZEN-modifizierte Oligos den Schmelzpunkt erhöhen können. IDT kann beim Entwerfen des Oligos hilfreich sein, aber seien Sie bereit, viel Geld für umfassend modifizierte RNA-Oligos auszugeben.

Antworten (3)

Ein Artikel wurde vor etwa einer Woche in Nature Biotechnology veröffentlicht und geht auf Ihre Frage ein, Maruyama T et al., 2015 . Ich muss sagen, dass ich die Strategie der Autoren äußerst clever fand.

Es geht nicht um Effizienzsteigerung durch Verringerung der Spezifität, sondern einfach um Effizienzsteigerung (was sowieso Ihr Endziel ist). Was die Autoren taten, war, die nichthomologe Endverbindung (NHEJ) zu hemmen, um die homologiegesteuerte Reparatur (HDR) zu fördern, zwei DNA-Reparaturmechanismen, die in Zellen konkurrieren, und natürlich ist HDR der Mechanismus, der für das CRISPR/Cas9-System benötigt wird.

Sie erreichen die NHEJ-Hemmung mit dem Molekül Scr7, einem DNA-Ligase-IV-Inhibitor, der wiederum NHEJ stört.

Mit Scr7 verstärkten sie die Insertion des Zielgens um das 3- bis 19-fache (je nach Zelllinie). Hier die Grafik, die diese Ergebnisse zeigt

Siehe Papierfiguren

Darüber hinaus erhöhte die Verwendung von 1 μM Scr7 über 24 h auf DC2.4-Zellen den Prozentsatz der transfizierten Zellen von 4,58 % auf 58,3 % , eine deutliche ~ 13-fache Steigerung. Hier ihre Ergebnisse:

Siehe Papierfiguren

Hoffentlich sollte dies Ihnen einige Ideen geben.

Interessante Antwort.
Sieht so aus, als hätten sie auch einzelsträngige DNA-Oligos für einige ihrer kurzen Insertionen verwendet (siehe ergänzende Tabelle 7) , was mit meiner auf Spekulationen basierenden Antwort unten übereinstimmt. Die längeren Einsätze sind immer noch doppelsträngig. Wäre interessant zu sehen, ob lange einzelsträngige DNA auch effizienter einfügen würde. Ich bin nur froh zu sehen, dass ich in die richtige Richtung spekuliert habe.
@cagliari2005, wow, danke!! Echt super.
Nur eine Nebenfrage: Ist es aus urheberrechtlicher Sicht in Ordnung, Diagramme aus Artikeln öffentlich zu posten?
@TMOTTM Es ist kein Plagiat, da ich die Quelle zitiere, aber in Bezug auf Urheberrechtsverletzungen denke ich, dass Sie Recht haben, darauf hinzuweisen. Da diese Zahlen von Nature Biotechnology stammen, darf ich sie nicht öffentlich veröffentlichen (ich habe sie tatsächlich entfernt) - siehe Nature-Richtlinie . Wenn sie aus Open-Source-Journalen (z. B. PLoS One) stammen, können Sie dies tun, da sie öffentlich verfügbar sind.
Ich weiß nicht, ich habe mich nur gefragt.. jedenfalls kann ich die Zahlen immer noch sehen, nur für den Fall.
@TMOTTM Jetzt kannst du nicht ;)

Ich werde dieser Antwort den Haftungsausschluss voranstellen, dass ich CRISPR/Cas noch nie verwendet habe, und hier gibt es eine Menge Spekulationen.

Aber ich denke, dass ein effizienter CRISPR-vermittelter Knock-in wahrscheinlich aus drei Teilen besteht: Targeting, Integration und Auswahl.

Das Targeting wird durch die Leit-RNA erreicht, die oft als DNA auf demselben Plasmid eingeführt wird, das für Cas9 kodiert, oder in vitro transkribiert oder synthetisiert werden kann, wenn sie als RNA geliefert wird. Ein Poster schlägt jedoch vor, dass ein richtig gestaltetes DNA-Fragment geliefert werden kann und ausreichende Mengen an Leit-RNA in situ produziert, um ein effizientes Schneiden zu erreichen.

Beim Integrationsschritt wird die Matrizen-DNA durch homologe Reparatur in den Doppelstrangbruch eingefügt. Homologe Reparatureffizienzen variieren stark von Zelle zu Zelle und sind oft weniger effizient als nicht-homologe Endverbindungen. Die Verwendung einer einzelsträngigen DNA könnte jedoch die Effizienz erhöhen.

Aber auch wenn nur ein kleiner Prozentsatz der Zellen korrekt bearbeitet wird, kann es möglich sein, diese Zellen auszuwählen und zu vergrößern. NEB beschreibt eine Cas9-GFP-Fusion (Seite 4), mit der GFP an eine bestimmte DNA-Sequenz gebunden werden kann. Es ist möglicherweise möglich, CFP- und YFP-Varianten dieses Konstrukts herzustellen und FRET zu verwenden, um Zellen mit dem Knock-in zu erkennen. (Hier kommt die Spekulation ins Spiel) Mit den beiden Fusionsproteinen und zwei Leit-RNAs für benachbarte Sequenzen im Knock-in Gen, können Sie möglicherweise Zellen erkennen, in denen ein CFP- und ein YFP-Cas9 nahe genug beieinander liegen, dass Sie FRET bekommen. Auf diese Weise können Sie möglicherweise Zellen nach FACS sortieren und diese Zellen dann wachsen lassen.

Wenn Ihr Knock-in ein membrangebundenes Protein an der Oberfläche freilegt, können Sie natürlich auch einfach markierte Antikörper verwenden, um dieses Protein nachzuweisen.

Danke, aber ich frage nicht, wie man die Zellen trennt. Ich frage, wie man Crispr dazu zwingt, eine höhere Erfolgsrate einzufügen. Wie man ihn weniger spezifisch macht oder auf welche Regionen man abzielt. Wenn es möglich ist. Und Ihr zweiter Link über Zinkfinger-Nukleasen und nicht über Crispr.
Beim zweiten Link geht es um homologe Rekombination. Bei CRISPR und Zinkfinger-Nukleasen geht es nur darum, die DNA zu schneiden, durch homologe Rekombination wird das neue Gen tatsächlich eingefügt. Und ich glaube nicht, dass Sie die CRISPR-Erfolgsrate einfach auf über 50 % aller Zellen bringen werden, die Rekombinationsrate wird wahrscheinlich niedriger sein. Eine gute Selektionsstrategie kann diese rekombinierten Zellen finden und Ihnen eine Population mit 100 % Rekombination geben.

Wenn Sie eine zufällige Integration wünschen, müssen Sie unspezifische gRNA-Sequenzen finden; Alles, was bisher für CRISPR entwickelt wurde, war auf präzise Integration ausgerichtet, nicht auf zufällige Integration.

Sprechen Sie mit einem Informatiker über das Herausziehen nicht eindeutiger Sequenzen aus dem menschlichen Genom. Sie müssen dann eine Bibliothek von 20nt-Sequenzen klonieren, die mit einer PAM-Sequenz (NGG) enden, und sie mit einem anderen Konstrukt, das ein Cas9 und das Insert codiert, in Zellen schmeißen.

Wenn Sie einfach nur eine Integration benötigen, brauchen Sie natürlich auch kein CRISPR – Sie können jeden beliebigen lentiviralen Standardvektor verwenden und erhalten eine stabile Zelllinie, die mit dem an zufälligen Stellen eingefügten Gen hergestellt wird. Die Verwendung von CRISPR dafür macht die Dinge sehr kompliziert.

OP sagt, er könne „nur CRISPR verwenden“.
Ja, ich bin mir dessen bewusst; Mir ist auch bewusst, dass dies eine massiv komplizierte und wahrscheinlich sehr ineffektive Vorgehensweise ist. Nicht zuletzt, weil das Aufstocken von etwas mit einer CRISPR-Targeting-Strategie oft Homologiearme von bis zu einem kb erfordert; und in diesem Szenario bedeutet dies, dass man nicht nur eine Bibliothek von sgRNAs erstellen muss, sondern auch eine Bibliothek seines Inserts, flankiert von 1 kb-Sequenzen für jeden Locus, auf den er abzielen möchte.
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