Mutationen/Deletionen mit CRISPR

Ich muss ein Protein daran hindern, aktiv zu werden, und nach einem universellen Weg suchen, dies zu tun. Bei Säugetieren.

Mit CRISPR ist es möglich, das gesamte Gen auszuschalten. Aber es ist ein wenig kompliziert (z. B. zwei gRNA erforderlich). Es gibt auch andere Gründe, also muss ich dies mit nur einer gRNA tun.

Also denke ich darüber nach, eine Mutation einzufügen.

Meine Frage : Gibt es eine Möglichkeit, eine Mutation vorzunehmen, die die Bildung eines funktionellen Proteins mit hoher Effizienz verhindert - mit einer gRNA. Und ohne die aktive Stelle des Proteins kennen zu müssen.

Zum Beispiel Frame-Shift oder Mutation um das Startcodon herum? Ist es möglich? Wenn ja, wie kann ich das tun? Wohin muss ich die gRNA schicken?

Danke.

Wenn Sie von einem System sprechen, geben Sie bitte an, ob es sich um eine Zelllinie oder ein Tier handelt. Zweitens, wenn Sie sagen "Es gibt auch andere Gründe", geben Sie diese auch an. Was meinen Sie auch mit "ohne die aktive Stelle des Proteins kennen zu müssen"?
Nun, synthetische CRISPR/Cas-Systeme haben die Möglichkeit, eine einzige Leit-RNA (sgRNA) zu haben.

Antworten (1)

Sie können mit einer einzigen gRNA auskommen. Alles, was CRISPR-Cas-, ZFN- oder TALEN-Systeme tun, ist, einen Doppelstrangbruch an einer bestimmten Stelle einzuführen. Die DNA wird über zwei Mechanismen repariert – nicht homologe Endverbindung (NHEJ) und homologe Rekombination (HR). NHEJ ist fehleranfällig und kann Indels einführen, die die Genfunktion beeinträchtigen können (Frameshifts usw.). Während HR verwendet werden kann, um ein Transgen zu integrieren oder eine Mutation zu reparieren, kann NHEJ verwendet werden, um Mutationen zu erzeugen.

Ich habe mit CRISPR-Cas kein Gen wirklich ausgeschaltet, aber es ist gut, auf den Anfangsteil des ORF abzuzielen. Es wird auch viele andere Faktoren geben, die bestimmen, welche Stelle für das Targeting ausgewählt werden sollte, und ein wichtiger Faktor wäre die Einzigartigkeit der Zielsequenz. Auf dieser Seite finden Sie Richtlinien zur Auswahl einer guten Zielsequenz.

Sie müssten dennoch ein strenges Screening durchführen; Der Vorteil des Insertions-Knock-Outs besteht darin, dass das Screening viel einfacher sein kann (z. B. durch Insertion eines GFP- oder Puromycin-Resistenzgens).

Sie können sich dieses Papier und die ergänzenden Informationen ansehen ; Sie haben 18080 Gene mit einer CRISPR-Cas-Bibliothek ins Visier genommen.

Ein großer Nachteil des Einsetzens ist die sehr schlechte Erfolgsrate. Weniger als 5 %. Also suche ich immer noch nach der Antwort. Wo im Gen zu schneiden, um Protein nicht funktionieren zu lassen. Über ORF habe ich über Startcodon geschrieben, brauche aber mehr Informationen und Quellen. Wo genau. Danke.
Und zur Einzigartigkeit, Off-Topic-Frage: Ist es möglich, eine gRNA herzustellen, die auf viele verschiedene Stellen im Genom abzielt? Nicht davon gehört. Unspezifische gRNA?
@VGranin die Einfügungsrate, auf die Sie sich beziehen, ist das Einfügen einer bestimmten Sequenz, eine unspezifische Indel-Mutation, die eine Frameshift verursacht, wie es bei WYSIWYG der Fall ist, kann Erfolgsraten von über 70% haben. Und die einzige Möglichkeit, mit einer einzigen gRNA auf viele verschiedene Stellen abzuzielen, besteht darin, dass alle Stellen eine gemeinsame Sequenz hätten, gRNAs spezifisch für eine bestimmte Sequenz sind.
@VGranin Wie gesagt, Sie können eine einzelne gRNA verwenden, um den Schnitt vorzunehmen. Auf jeden Fall vor dem Startcodon, aber nicht zu weit entfernt (wenn Frameshift bei Nonsense-Mutation auftritt, haben Sie nur ein wenig von der ursprünglichen Sequenz). Sie müssen also zwischen der Nähe vom Startcodon und anderen Faktoren wie der einzigartigen Site und anderen, die in dem Link erwähnt werden, den ich in der Antwort angegeben habe, optimieren.
@Luigi. Danke schön. Aber er erwähnt eine GFP-Einfügung ... Wie auch immer, was CAS9 macht, ist nur eine Pause. Eine unspezifische Einfügung ist nicht etwas, was wir tun, es ist die Art und Weise, wie Zellen repariert werden. Was ich brauche, ist ein Ort, an dem gRNA anvisiert werden kann, um eine Pause zu machen, die das Protein nicht mehr funktionieren lässt.
@Luigi Bist du dir bei den 70% sicher; es hängt von vielen Faktoren ab, darunter Zelltyp und Zellzyklusstadium.
@VGranin Ich habe erwähnt, dass Sie auch eine Insertionsmutagenese durchführen können, die zwar zwei gRNAs erfordert, das Screening jedoch erheblich vereinfacht (Sie können die Knockouts mit FACS sortieren).
@WYSIWYG für einen direkten DS-Knockout sehen wir normalerweise zwischen 40% und 70% erfolgreich, je nach Ziel
@Luigi vielleicht sollten wir das im Chat besprechen, aber welche Zellen sind das? Und wie screent man? PCR? Screening ist die irritierendste Sache
@ WYSIWYG, danke. Also in der Nähe des Startcodons. Aber gibt es ein Papier, das dies in verschiedenen Situationen und Proteinen getan hat - und einige Erfolgszahlen usw. zeigt? Weil ich nicht finden kann. Danke.
Wir verwenden die Puromycin-Resistenz, um positiv auf transfizierte Zellen zu selektieren, nach dieser Selektion (mit einer Transfektionseffizienz von jetzt 100%) sehen wir 40%-70% Erfolg beim PCR-Screening (was definitiv ein Schmerz ist). @VGranin In diesem Dokument erfahren Sie alles, was Sie jemals über die Durchführung von CRISPR-Knockouts wissen müssen
@VGranin auch dieses Papier. Sie haben einen Knockout im Genommaßstab für 18080 Gene durchgeführt (natürlich nicht gleichzeitig).
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