Gibt es ein Protokoll zum Einfrieren und Auftauen von Bacillus subtilis-Zellen?

Es gibt ein Buch, in dem steht, dass Bacillus-Sporen in 50 % Glycerin bei -70 Grad Celsius gelagert werden sollen (es wird nicht erwähnt, ob die 50 % die Endkonzentration sind oder nicht). Aber soweit ich weiß, können die Zellen selbst in jedem % Glycerin gelagert werden, solange die endgültige Glycerinkonzentration 15 % (v/v) bei -80 Grad Celsius beträgt.

Gibt es einen Unterschied zwischen der Konservierung von Sporen und Zellen? Weil das Buch sagte, die Zellen bei einer bestimmten Glycerinkonzentration und die Sporen bei einer anderen Glycerinkonzentration zu konservieren.

Sagen wir auch, ich kratze einige B. subtilis aus dem Kryovial zur Wiederverwendung und sie sind eingefroren. Warte ich, bis die abgekratzten Zellen aufgetaut sind, und plattiere ich sie dann, oder plattiere ich sie, während sie noch gefroren sind?

Und wenn ich diese Zellen sporulieren möchte, sollte ich diese gefrorenen Zellen durch Ausplattieren und Inkubieren über Nacht zurückgewinnen, oder kann ich sie einfach direkt in das Sporulationsmedium fallen lassen? Ich möchte die Details richtig auf den Punkt bringen.

Willkommen in der Biologie! Sie möchten B. stubilis lagern und später wieder anbauen können oder zu welchem ​​Zweck stellen Sie diese Frage? Warum glauben Sie auch, dass ein Standard-Glyzerin-Strumpfverfahren für E. coli für Sie nicht funktioniert? Hintergrundinformationen helfen den Leuten, Ihre Frage zu beantworten.
Ich rate Ihnen, Ihre ursprüngliche Frage zu bearbeiten und diese Details hinzuzufügen
Danke für die Änderungen. Ich habe nur hier und da ein paar Leerzeichen eingefügt
Dies ist nur anekdotisch und ich kenne nicht die beste Methode, aber ich habe B. subtilis- Zellen in 50% Glycerin bei -80 ° C gelagert . Für die Proteinproduktion würde ich die Stammlösung vollständig auftauen, sie ausplattieren, um Log-Phase-Zellen zu erhalten, und dann das Wachstumsmedium inokulieren. Hat jedesmal funktioniert.

Antworten (1)

Obwohl ich noch nie Bakterienstammkulturen aus Sporen angelegt habe, halte ich dies nicht für notwendig, da das Standardverfahren zur Herstellung von Bakterienstammkulturen problemlos funktionieren sollte.

Dafür züchten Sie Ihre Bakterien in Flüssigkultur, bis Sie die späte logarithmische Phase erreichen (also viele Bakterien in Ihrem Medium haben), nehmen Sie 1 ml der Kultur, mischen Sie sie mit 100 % Glycerin, um eine endgültige Glycerinkonzentration von 50 zu erreichen % und dann bei -80°C einfrieren. Daran können Sie es lange lagern (wahrscheinlich nicht unbegrenzt, aber über Jahre möglich).

Wenn Sie Ihre Kulturen wieder zum Leben erwecken möchten, nehmen Sie das Röhrchen und kratzen Sie entweder mit einer Impföse oder einer Pipettenspitze etwas von der gefrorenen Kultur ab und plattieren Sie es auf einer geeigneten Agarplatte aus. Wenn Sie skalieren möchten, nehmen Sie eine Kolonie von der Platte in flüssige Medien.

Da Glycerin beim Pipettieren mühsam ist (und auch Sterilitätsprobleme haben kann), bin ich auch für Bakterienkulturen auf DMSO als Kryoschutzmittel umgestiegen. Geben Sie einfach 15 % (Endkonzentration) DMSO in die Kryoröhrchen (also 150 ul DMSO auf 850 der Kultur), mischen Sie und frieren Sie dann die Zellen ein. Meiner Erfahrung nach funktioniert das so gut wie Glycerin.

+1 - nur aus philosophischer Neugier sagen Sie, wenn Sie Ihre Kulturen wieder zum Leben erwecken möchten ; halten sie ihre zellen bei -80°C für tot ?
Zumindest wachsen sie nicht und machen keinen Stoffwechsel. Ich würde sagen tot, ausruhen passt wohl besser.
Gibt es ein Protokoll zum Einfrieren und Auftauen von Bacillus subtilis-Zellen?
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