Ist es möglich, DNA einzufügen, ohne die Erkennungsstelle mit CRISPR/Cas9 zu schneiden?

Wir suchen nach einer Möglichkeit, DNA in ein Genom einzufügen, aber wir möchten dies so tun, dass die Erkennungsstelle intakt bleibt, um erneut DNA an derselben Stelle hinzufügen zu können. Wissen Sie, ob es möglich ist oder ob CRISPR/Cas9 es bereits tut? Anscheinend wurden bereits mehrere Systeme entwickelt, aber die wenigen Artikel, die wir lasen, befassten sich nicht mit unserem Problem.

Aufrichtig,

Emilie

Einfügen in das Genom welchen Organismus?
Warum stellen Sie nicht einfach sicher, dass Ihr eingefügtes DNA-Segment dieselbe CRISPR/Cas-Erkennungsstelle enthält, damit Sie es einfach erneut schneiden können?
@MarchHo Ich hatte anfangs den gleichen Gedanken, aber dann würde Cas auch Ihre Ziel-DNA schneiden. Darüber hinaus würde die Ziel-DNA auch einen Homologiebereich aufweisen, der Ihr gewünschtes Insert nicht enthält, und es könnte eine Reparatur stattfinden, die nicht zur Insertion Ihrer gewünschten Sequenz führt.
Wir würden es gerne auf das E.coli-Genom anwenden.
@canadianer Und Cas9 ignoriert auch die Methylierung. Vielleicht eine andere Nuklease (z. B. ZFN oder TALEN) ausprobieren, die von der Methylierung betroffen ist?
@EmilieCuillery Gibt es einen Grund, warum Sie nicht einfach ein Plasmid verwenden können?
Das Schöne an CRISPR/Cas ist, dass die Zielerkennung durch RNA erfolgt, die relativ einfach/günstig zu erhalten ist. Könnten Sie einfach eine andere gRNA bekommen, die die neue Sequenz nach dem Einfügen erkennt?
@MarchHo, wir könnten das tun, aber dann hätten wir kleine Sequenzen, die von den ehemaligen Erkennungsstellen kommen und unsere hinzugefügte DNA "verschmutzen". Unsere Frage wäre mehr als: Wissen Sie, ob Cas9 in der Mitte der Erkennungsstelle schneidet oder ob ein speziell konstruiertes Protein Cas existiert, das nach der Erkennungsstelle schneidet (was auch immer die zu schneidende Sequenz ist)?
Was wir tun wollen, ist, immer wieder dieselbe Sequenz an derselben Stelle einzufügen, wobei nur eine Erkennungsstelle verwendet wird. Scheint es verrückt? Wir suchen, suchen seit einigen Tagen, haben aber immer noch Probleme, den wirklichen Mechanismus von CRISPR/CAS9 zu verstehen ... @MarchHo, wir werden sicher ein Plasmid verwenden, um das gewünschte Protein zu erhalten, dann möchten wir, dass unser Protein wirkt und immer wieder, indem DNA immer wieder hinzugefügt wird, jedes Mal, wenn das Genom erhöht wird (mit Begriff der Ordnung)
Bei einem konstruierten Cas bin ich mir nicht sicher, aber ich denke, Nukleasen wie TALEN spalten die Erkennungssequenz nicht. Das Problem, mit dem Sie meiner Meinung nach konfrontiert werden, ist, dass Ihr Insert auch die Erkennungssequenz enthalten muss, um homolog zu sein, und daher auch gespalten würde. Sie könnten erwägen, eine mutierte Erkennungssequenz im Insert zu verwenden, damit sie nicht gespalten wird, aber dennoch eine ausreichende Homologie aufweist, um für die Reparatur verwendet zu werden. Selbst dann würde ich erwarten, dass die Zielsequenz in der gDNA durch die mutierte Version im Insert ersetzt wird, wenn Nukleotide aus dem Doppelstrangbruch reseziert werden.
@canadianer "Cas würde auch deine Ziel-DNA schneiden" - wie wäre es, die Ziel-DNA irgendwie zu schützen?
Ich denke, die beste Option wäre, Schutzgruppen hinzuzufügen, die später entfernt werden können, nachdem Cas9 gelöscht wurde. Falls es jemals gelöscht wird. Ich habe geringe Kenntnisse durch Gentechnik. :D

Antworten (1)

Sehen Sie sich die ortsspezifische Rekombination an . Sie können eine ortsspezifische Rekombinase verwenden, insbesondere eine Integrase, die eine DNA-Sequenz an einer bestimmten Bindungsstelle einfügen kann. Sie können eine identische Bindungsstelle in die einzufügende DNA-Sequenz einfügen, was die Reintegration einer neuen Bindungsstelle ermöglicht. Beachten Sie jedoch, dass Sie möglicherweise SSR auf das Insertionsplasmid selbst bekommen, also tun Sie dies nicht, wenn Sie eine bestimmte Menge an Integration benötigen.

Betrachten Sie die untere Teilfigur von A für ein Integrationsbeispiel.

Betrachten Sie die untere Teilfigur von A für ein Integrationsbeispiel. Rekombinasen können basierend auf der Orientierung der Bindungsstellen auch andere Dinge tun, wie z. B. Exzision und Inversion.

Verwendet aber kein CRISPR. Recht?
Es scheint, dass dies auch unter den gleichen Problemen leidet, auf die in den Kommentaren hingewiesen wird. Wenn Ihr Insert die Rekombinationsstelle hat, kann es mit Kopien von sich selbst rekombinieren.
Unsere Projekte basieren im Wesentlichen auf Rekombinase. Und Arbeit ... vor 2 Monaten veröffentlicht ... aber nicht von uns :( Wir suchen also nach einer besseren Effizienz (10 ^ -4 mit Rekombinase), die ein schnelleres System ermöglicht. Soweit ich weiß, erlaubt CRISPR / Cas9 keine Einfügung von mehreren DNA-Stücken an der gleichen Stelle, aber Cas9 ist ein sehr mächtiges Werkzeug, glauben Sie, wir könnten es so konstruieren, dass es nicht die homologe Sequenz, sondern direkt danach oder davor schneidet? (Wir haben wirklich Probleme zu verstehen, woher die DNA kommt, die wir einfügen wollen und den genauen Mechanismus davon Denken Sie an einen anderen schnelleren Weg als die Rekombinase?
Wie auch immer, ich danke Ihnen allen für Ihre Hilfe, aber ich denke, wir werden die Idee vorerst aufgeben, da wir in unseren Recherchen erfahren haben, dass die Cas9-Rate und -Effizienz viel zu niedrig ist, um das zu tun, was wir wollen ... es tut mir leid! Aber danke nochmal für deine Hilfe :)
Ist es möglich, DNA einzufügen, ohne die Erkennungsstelle mit CRISPR/Cas9 zu schneiden?
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