Ist es möglich, einen Strang doppelsträngiger DNA in vivo zu entfernen?

Angenommen, wir haben eine doppelsträngige DNA-Sequenz in menschlichen Zellen, sagen wir

...ATCGATATCGATATTGCAGAGCATAGCTATAA...
...TAGCTATAGCTATAAGCTCTCGTATCGATATT...

Jetzt möchte ich einen Strang spalten, so dass ich es habe

...ATC..........................TAA...
...TAGCTATAGCTATAAGCTCTCGTATCGATATT...

Der Abstand ist mir nicht so wichtig, also können es 20 bp sein, die ich entferne oder 1000s. Wenn ich also etwas PAM oder so benötige und es nicht in der Nähe der Ziellöschungsstelle ist, werde ich einfach in 5' bzw. 3' Richtung bis ich es finde und dort spalte, solange sichergestellt ist, dass ich die Zielstelle dann einzelsträngig habe.

Ich wäre Ihnen sehr dankbar, wenn Sie mir hier weiterhelfen könnten!

Ich verstehe nicht, was Ihre Frage ist - warum versuchen Sie, einen einzelnen Strang in vivo zu entfernen ? Was ist PAM in diesem Zusammenhang? Bitte bearbeiten Sie Ihre Frage, um zusätzliche Erklärungen und Details hinzuzufügen.

Antworten (1)

Sowohl TALEN- als auch ZFN-Geneditierungstechnologien verwenden ein Paar einzelsträngiger Endonukleasen, die letztendlich zu einem Doppelstrangbruch führen. Cas9 in der CRISPR-Cas-Technologie schneidet jedoch beide DNA-Stränge (es gibt einige Cas-Enzyme in bestimmten Bakterienarten, die nur einen einzelnen Strang schneiden [ref] ).

     Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Bild mit freundlicher Genehmigung: http://www.xenbase.org/other/static/CRISPr.jsp

Wenn Sie also eine einzelne Einheit des Paares verwenden, können Sie einen Strang der DNA schneiden. Sie können eine andere Nuklease verwenden, um an einer anderen Stelle im selben Strang einen Schnitt zu bewirken. Dies führt immer noch nicht zur Entfernung der DNA-Sequenz zwischen den beiden Schnittstellen. Es gibt keine verfügbare Technologie, die dies in-vivo tun kann . Möglicherweise (eine wilde Vermutung) können Sie ein modifiziertes Oligonukleotid (oder sogar eine IVT-synthetisierte RNA) verwenden, das an diesen Sequenzabschnitt binden und seine Wechselwirkung mit dem anderen DNA-Strang unterbrechen kann. In jedem Fall wäre ein Abschnitt der ssDNA nicht stabil und würde schnell durch Polymerase repariert.

Vielen dank für Ihre Antwort. Eine andere Sache, die für mein Projekt ausreichen würde, wäre, dass an einer bestimmten Stelle die DNA in vivo abgewickelt wird (vielleicht durch ein CAS-Enzym wie dCas9, obwohl andere hier besser geeignet wären). Dann könnte einer der Stränge von der Maschine "versteckt" werden, aber der andere sollte zugänglich sein, um damit herumzuspielen. Ist so etwas möglich?
@tobias Die Möglichkeiten sind unendlich, aber wir sollten uns für die entscheiden, die im Prinzip am einfachsten und einfach zu implementieren ist.
Sicher :). Was würdest du dafür vorschlagen?
@tobias Ich glaube nicht, dass ein solches Protein noch entwickelt wurde. Das wäre ein Forschungsprojekt für sich und man müsste viele experimentelle Versuche machen. Daher kann ich diesbezüglich nicht viel vorschlagen - Sie müssten es versuchen. Was ich in der Antwort gesagt habe (die Vermutung), wäre das erste, was ich versuchen würde, weil es einfach ist.
Vielen dank für Ihre Antwort. In Bezug auf die zweite Frage, wo ich versuche, einen großen ssDNA-Strang zu haben, könnte ich dCAS9 mit einer Helikase fusionieren, so dass das dCAS9 sequenzspezifisch an die dsDNA bindet, die DNA öffnet und die Helikase sie für, sagen wir, mehrere öffnet zehn bps. Ist das realistisch?
@tobias Klingt gut, aber wie gesagt, es kann ein Forschungsprojekt für sich sein. Manchmal funktioniert selbst das perfekteste Design auf Papier im Labor nicht (ist mir dreimal passiert). Beim Entwerfen eines neuen Werkzeugs besteht immer ein gewisses Risiko. Es kann funktionieren oder auch nicht. Wenn Sie möchten, können Sie es versuchen. Darüber hinaus würde sogar der Entwurfsschritt viel Nachdenken erfordern (wie die Proteine ​​fusionieren, wie die Domänen interagieren usw.).
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