Ich versuche, ein Nasslaborexperiment ohne nennenswerte Nasslaborerfahrung zu entwerfen.
Gerade jetzt, in meinem Traumland, wäre es hervorragend, wenn es möglich wäre, eine Caspase-9-Knockout-Maus zu erschaffen (eine Schädigung des Caspase-9-Gens wird mit der Entstehung von Brustkrebs in Verbindung gebracht) und irgendwie in der Lage zu sein, die Entwicklung zu kontrollieren des Brustkrebs-Phänotyps, sodass ich sowohl eine Caspase-9-KO-Kontrollgruppe als auch eine Nicht-Caspase-9-Kontrollgruppe erstellen kann. Insgesamt hätte ich gerne folgende Kontrollgruppen:
1. Normal mouse - normal Caspase9 gene, no breast cancer phenotype
2. Caspase9 KO mouse - no breast cancer phenotype
3. Caspase9 KO mouse - breast cancer phenotype
Kann mir jemand helfen zu beantworten, ob Gruppe 2 oben möglich ist oder nicht? Können Sie mich auf Papiere, Experimente verweisen, wo dies zuvor durchgeführt wurde oder unten versucht wurde und fehlschlug?
Hier ist ein Papier, das über die Assoziation von Caspase-9 mit der Entwicklung von Brustkrebs spricht: http://breast-cancer-research.com/content/pdf/s13058-014-0443-5.pdf . Caspase-9 ist ein Typ-2-Mitglied der Caspase-Proteinfamilie. Wenn ich vom "Caspase-9-Gen" spreche, spreche ich von der DNA, die für diese zellulären Apoptose-Empfindlichkeitsproteine 9 (Caspase-9) kodiert. Das ist nicht mein Fachgebiet, aber das ist, was ich derzeit verstehe.
Die kurze Antwort ist, dass es wahrscheinlich ein schlechtes Experiment ist; da dies teuer wäre und wahrscheinlich keine nützlichen neuen Informationen liefern würde.
Die lange Antwort (d. h. warum) ist die Identifizierung eines interessanten Zielgens (z. B. Caspase-9 bei Brustkrebs). Dies ist nur der erste Schritt, und vor der Planung eines Experiments (insbesondere eines teuren, das zahlreiche Mäuse).
Caspase-9 ist ein kritischer Effektor der Apoptose über den mitochondrialen Weg. Viele verschiedene Signale wie DNA-Schäden, Stress des endoplasmatischen Retikulums usw. veranlassen Zellen, über diesen Weg zu sterben. Dies ist sowohl für die normale Entwicklung als auch für die Krebsprävention wichtig. Die homozygote Deletion von Caspase-9 ist tödlich, die Mäuse werden nicht erwachsen. ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK6153/ ) Ein bedingter Knock-out von Caspase-9 in Brustkrebszellen wäre erforderlich, keine globale Löschung.
Außerdem dürfte dieses Experiment angesichts der bekannten Funktionen von Caspase-9 keine interessanten neuen Informationen liefern. Dieser Weg ist gut charakterisiert und spielt bekanntermaßen eine wichtige Rolle bei Krebs (Widerstand gegen den Zelltod; ein Kennzeichen von Krebs: http://www.cell.com/abstract/S0092-8674(11)00127-9 ) 9-Aktivität macht Zellen resistent gegen apoptotische Signale durch den mitochondrialen Signalweg (sie sterben nicht, wenn sie diese „Selbstmord“-Signale empfangen). Dadurch können mutierte Zellen überleben, wenn sie sonst sterben sollten. Krebszellen können auch auf andere Weise gegen diesen Weg resistent werden (z. B. die Hochregulierung von anti-apoptotischen Bcl-2-Familienmitgliedern.
Viele Wissenschaftler untersuchen bereits, wie die normale Funktion dieser Bahnen bei verschiedenen Krebsarten wiederhergestellt werden kann; Was hoffen Sie zu lernen, wenn Sie es knacken, das noch nicht bekannt ist (ich sage nicht, dass es keinen guten Grund geben kann, aber wenn Sie keinen haben, sollten Sie es nicht tun.)
Dies scheint ein Standard-Knockout- und Complementation-Rescue-Experiment zu sein.
Rasse 2 kann aus Rasse 3 hergestellt werden (unter der Annahme, dass das Caspase 9-Gen tatsächlich Krebs verursacht, wenn es nicht exprimiert wird).
Erstens Knockout Caspase 9 aus einem Wildtyp, wodurch Rasse 3 entsteht. Überprüfen Sie, ob der Krebsphänotyp gezeigt wird und statistisch signifikant ist.
Transformieren Sie dann Rasse 3 mit einer künstlichen Kopie des Caspase 9-Gens an einer alternativen chromosomalen Stelle. Diese Rasse (Rasse 2) dient als positive Kontrolle für das Gen und sollte sich identisch mit dem Wildtyp verhalten.
Schließlich können Sie dann mehrere Rassen von Mäusen produzieren, die mit verschiedenen Versionen des Gens transformiert wurden (z. B. Serin/Threonin-Mutagenese zum Nachweis der Kinase-Spezifität), um Mutationen zu bestimmen, die dazu führen, dass das Caspase-9-Protein nicht mehr funktioniert. Alternativ kann dasselbe Gen, aber mit einem stärkeren/schwächeren Promotor, verwendet werden, um die dosisabhängigen Wirkungen des Gens zu bestimmen.
Diese Veröffentlichung bezüglich eines Gens für die zirkadiane Uhr zeigt das allgemeine Verfahren, das erforderlich ist, um ein solches Complementation-Rescue-Experiment durchzuführen.
Es scheint, dass Sie mit einem anderen Gen anstelle von Caspase 9 verwechselt werden, aber wenn KO eines Gens die Entwicklung von Brustkrebs verursacht und Sie etwas zwischen nicht krebsartigen und krebsartigen Zuständen vergleichen möchten, können Sie mehrere Wege gehen:
Sehen Sie, ob Sie Wurfgeschwister haben könnten, die Krebs tragen und nicht tragen. Du könntest sie vergleichen. Manchmal exprimiert der Phänotyp bei Mäusen im Laufe des Lebens oder in einem jüngeren Alter nicht 100%.
Brustkrebs ist bei männlichen Menschen selten, wahrscheinlich auch bei männlichen Mäusen; Ich denke, Sie könnten das, was Sie sehen möchten, zwischen Männern und Frauen vergleichen.
Wenn Sie KO-Mäuse mit anderen Stämmen kreuzen, kann das Auftreten des Phänotyps variieren. Dann könnten Sie vergleichen, was Sie zwischen weniger und anfälligeren Mäusestämmen sehen möchten.
aaaaa sagt Monica wiedereinsetzen
aaaaa sagt Monica wiedereinsetzen
Benutzer137
Benutzer137
aaaaa sagt Monica wiedereinsetzen
März Ho
WYSIWYG
WYSIWYG
243
InactionPotential