Was sind die räumlichen (lateral und axial) und zeitlichen Auflösungen, die man mit den folgenden optischen Abbildungsverfahren erwarten kann?
Sind sie besser als die anderen, wenn es darum geht, höhere Auflösungen bereitzustellen?
Die laterale und axiale Auflösung hängt von der numerischen Apertur Ihres Objektivs ab (lateral = Lambda/2NA; axial = 2Lambda/NA^2). Sie können die axiale Auflösung mit FLI verbessern, indem Sie einen konfokalen Ansatz oder mit 2-Photonen-Mikroskopie (2PM) verwenden. Um 14:00 Uhr benötigen Sie die Absorption von zwei Infrarotphotonen, um eine Emission zu erhalten. Die Wahrscheinlichkeit der 2 Infrarotabsorption hängt quadratisch von der Anregungsintensität ab. Daher wird die Fluoreszenz dort eingeschränkt, wo der Beleuchtungsstrahl fokussiert wird, was eine bessere Schnittbildung ergibt. Ein Vorteil von 2PM ist die höhere Eindringtiefe und die Verringerung der Phototoxizität. Tatsächlich können Sie 2 Infrarotphotonen verwenden, um Fluorophore anzuregen, was eine sichtbare Anregung erforderte.
Die zeitliche Auflösung hängt von dem zu messenden Bereich und der Integrationszeit ab.
Die Auflösung wird durch die Beugung begrenzt. Im besten Fall können Sie mit den 3 von Ihnen erwähnten Bildgebungsverfahren eine laterale Auflösung von ~ 200-300 nm und eine axiale Auflösung von 500 - 800 nm erzielen. Eine höhere Auflösung kann durch die Verwendung von Superauflösungstechniken erreicht werden. Sie werden in zwei Gruppen getrennt. Die erste nutzte die photophysikalischen Eigenschaften des Fluorophors, um es anzuregen und abzuregen. Dies ermöglicht die Auflösung von Sub-Beugungsbereichen. Dies ist der Fall bei STED (Stimulated Emission Depletion)-Mikroskopie oder SSIM (Saturated Structured Illimation Microscopy). Die zweite Gruppe nutzt die Fluktuation der Fluorophor-Emission, um sie besser zu lokalisieren. Es umfasst Techniken wie STORM (STochastic Optical Reconstruction Microscopy), PALM (Photo-Activated Localization Microscopy) und SOFI (Super-Resolution Optical Fluctuation Imaging).