Lentivektor-Biosicherheit

Lentivektoren werden in der Molekularbiologie häufig verwendet, am häufigsten, um ein gewünschtes Gen auf stabile Weise zu transduzieren. Dieses Vektorsystem nutzt die Fähigkeit von Viren aus, ihr eigenes Genom in die Wirtszelle einzuführen. So werden die Lentivektoren in eine Produzentenzelllinie (typischerweise HEK) transfiziert und dort Viren mit dem gewünschten Insert produziert. Schließlich werden diese Viren geerntet und die gewünschten Zelllinien transduziert.

Aus Gründen der biologischen Sicherheit ist dieses System so konstruiert, dass das Risiko durch das "Virensystem" reduziert wird. Die von diesem System produzierten Viren sind also nicht replikationsfähig, das heißt, soweit ich das verstanden habe, können sich die gebildeten Viren dann im zweiten Wirt nicht mehr bilden, da die verantwortlichen Gene nicht rekrutiert werden. Offensichtlich können sich die verwendeten Plasmide jedoch rekombinieren und bieten die Möglichkeit, ein replikationsfähiges Virus zu erzeugen. Doch soweit ich in der Literatur gefunden habe, wurde dies nie entdeckt und steht als theoretische Möglichkeit.

Meine erste Frage, in tatsächlichen Zahlen, wie hoch ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein solches Ereignis stattfinden würde (die Anzahl der Rekombinationen an den spezifischen Orten) . In diesem Fall wäre das Lentivektorsystem potenziell gefährlich, da dieses System meistens auf HIV basiert. Außerdem verwenden diese Vektoren nicht das endogene HIV-Hüllprotein, sondern VSV/G aus dem vesikulären Stomatitis-Virus, um den Tropismus und die Stabilität zu erhöhen.

Außerdem werden, obwohl von HIV abgeleitet, die meisten HIV-Gene aus den Lentivektoren entfernt, aber meiner Meinung nach sind die wichtigsten dort. Zweite Frage, wenn man all dies berücksichtigt, könnte dieses theoretisch "erzeugte" Virus schließlich AIDS oder andere nachteilige Auswirkungen verursachen? Es ist bemerkenswert, dass es jetzt aufgrund des VSV-Proteins in der Lage ist, fast alle menschlichen Zellen zu infizieren. Ist es dann richtig zu glauben, dass die Krankheit viel schlimmer und viel ansteckender wäre als das ursprüngliche HIV? Beachten Sie, dass sogar die Stabilität erhöht wird.

Ich kann mir jedoch auch vorstellen, dass dieses rekombinante neue Virus trotz des erhöhten Tropismus tatsächlich vom Immunsystem zerstört werden kann, da das vesikuläre Stomatitis-Virus beim Menschen keine Pathologien verursacht und möglicherweise dieses Protein als Antigen wirkt und kann eine ausreichende Immunantwort hervorrufen.

Zu guter Letzt, würde ein rekombinanter Virus theoretisch durch einen Standard-HIV-Test nachgewiesen werden?

Der Einfachheit halber beziehe ich mich auf Lentivektoren der dritten Generation

Ich bin mir nicht sicher, was Sie mit "die verwendeten Plasmide können rekombinieren" meinen, es gibt kein Plasmid, das das virale Genom enthält, nur die Hülle und einige Rezeptorproteine. Der Rest des viralen Genoms ist nicht einmal vorhanden, er wurde durch das Gen von Interesse ersetzt, das Sie hinzugefügt haben. Daher wäre es nahezu unmöglich, einen aktiven Virus mit nur drei oder vier Genen zu erschaffen, selbst wenn wir es versuchen würden. Vielleicht habe ich Ihre obige Aussage falsch verstanden, korrigieren Sie mich, wenn ich es getan habe.
Ich würde sagen, es ist wahrscheinlicher, dass ein lentiviraler Vektor bei einem Patienten verwendet wird, der eine aktive HIV-Infektion hat. Dies könnte auch hypothetisch ermöglichen, dass das rekombinante Gen in ein funktionsfähiges Virus eingebaut wird. Dies ist wahrscheinlich noch nicht geschehen, da die Anzahl der Menschen, die lentivirale Vektoren erhalten, bisher sehr gering ist (vielleicht null? Ich habe noch nichts von lentiviralen klinischen Studien gehört, aber ich habe auch nicht nachgesehen).
CDB> das Envelope (VSVg), plus das gag-Gen (Polyprotein), das pol-Gen (Integrase, reverse Transkriptase, RNAse H, HIV-Protease), das rev-Gen (viraler mRNA-Export aus dem Zellkern), das in den transfizierten Lentivektoren gefunden wird, kann mehrere Male rekombinieren um ein "provirales" DNA-Stück zu produzieren, das in der Lage ist, all diese Gene in den späteren Generationen zu codieren.
Luigi> danke für deine Antwort user137> ich verstehe dich nicht. zunächst einmal, wie wollen sie mit diesem system die bereits existierenden hiv-viren stabil transduzieren? Außerdem würden Sie, selbst wenn dies der Fall wäre, ein transgenes HIV bekommen, aber es ist grundlos zu glauben, dass Sie jedes HIV-Partikel im Körper als solches anvisieren würden, sodass diese die Infektion + Krankheit weiter verewigen würden. Außerdem, welches Gen wollen Sie in das Virus übertragen, um es zu töten? und ja, ich denke, es gibt solche Studien, aber überprüfen Sie es noch einmal.
@Katz Ich sage, dass Sie versehentlich einen lentiviralen Vektor bei einem AIDS-Patienten verwenden könnten oder dass jemand, der den lentiviralen Vektor erhält, später HIV bekommen könnte. Wenn beide Viren dieselbe Zelle treffen, könnte die vom Lentivirus gelieferte rekombinante DNA in eine virale RNA transkribiert, in ein Kapsid verpackt und in den Körper geschickt werden, um neue Zellen oder vielleicht andere Menschen zu infizieren. Während dieses neue Virus wahrscheinlich replikationsdefizient wäre, könnte es Probleme verursachen. Aus diesem und anderen Gründen mag ich keine virale Gentherapie.
Solange es nicht replikationsfähig ist, würde ich mich nicht um die replikationsinkompetente Virusgeneration kümmern, sie können keine Krankheiten produzieren und das einzige Risiko, das sie darstellen, ist die Insertionsmutagenese, was ich statistisch gesehen nicht so schlimm finde (korrigieren Sie mich ansonsten ), das einzige Problem, das ich denke, ist, dass, falls die von Lentivektoren produzierten Viren ein Onkogen als Insert haben, dies ein höheres Risiko darstellt. In Bezug auf die virale Pathogenität besteht das eigentliche Problem darin, dass selbst das replikationsinkompetente Virus aufgrund genetischer Umlagerungen replikativ werden kann
Ich möchte das tatsächliche Risiko dafür wissen, wenn es passiert, die tatsächlichen Chancen, eine Krankheit zu erzeugen, und auch, ob dieses theoretische Virus nachweisbar wäre> ob wir völlig blind sind, um ein zufälliges Ereignis zu überprüfen, das beim Umgang mit Lentivektoren passieren könnte oder nicht

Antworten (1)

Wie viele Rekombinationen sind erforderlich, um ein aktives Virus zu erhalten?

Die FDA hat die Wahrscheinlichkeit erkannt , dass Lentivektoren in aktiv replizierende Lentiviren umgewandelt werden können, wenn sie bei einem HIV-positiven Patienten einer Rekombination mit dem Wildtyp-HIV unterzogen werden. In diesem Fall sind zwei Rekombinationsereignisse erforderlich, um die Lentivektorsequenz in die HIV-Sequenz zu übertragen (der Übertragungsmechanismus ist identisch mit dem Fall von Lentivektoren der ersten Generation).

Dieser Artikel von VCU beschreibt einen anderen Mechanismus, durch den dies in Lentivektorsystemen der ersten Generation auftreten kann, der aus zwei Rekombinationsereignissen zwischen dem Lentivektor und dem Helferplasmid besteht. Beachten Sie, dass die 3 Gene gag, pol und env auf demselben Plasmid vorhanden sind und dass das Plasmid von LTRs flankiert wird. Lentivektoren der zweiten Generation, wie z. B. das pLKO-System , leiden nicht unter diesem Problem und benötigen Wildtyp-HIV, um aktiv replizierendes Lentivirus zu produzieren.

Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass dies geschieht, teilen Lentivektorsysteme der zweiten und dritten Generation die Gene in mehrere Plasmide auf, was dann mehr Rekombinationsereignisse erfordert, um replikationsfähige Viren zu produzieren. Zusätzlich wird der polyA-Schwanz des 3'-LTR ersetzt, um die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von Rekombinationsereignissen zu verringern.

Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Gemäß dem Artikel von Addgene über die Biosicherheit von Lentivektoren weist das Transferplasmid des interessierenden Gens (sowohl der 2. als auch der 3. Generation) eine Deletion in der 3'-LTR-Region auf, die verhindert, dass es replikativ aktiv wird. Daher besteht die einzige Wahrscheinlichkeit für das Auftreten der Rekombination darin, dass die Zelllinie, die das Virus exprimiert, einer Replikation mit einem aktiven Wildtyp-HIV-Stamm unterzogen wird. Ein Beispiel ist dieses pLKO-Transferplasmid , das ein verkürztes 3'-LTR enthält, wodurch verhindert wird, dass die Sequenz außerhalb von E. coli repliziert wird, das sie nicht unter Verwendung des LTR, sondern unter Verwendung des Plasmid-Replikationsursprungs repliziert.

Sind die durch Rekombinationen produzierten aktiven Viren in freier Wildbahn gefährlicher als Wildtyp-HIV?

Dies ist schwer zu beantworten, da die Rekombination nur die Bildung eines aktiven Virus ermöglicht, aber nicht garantiert, dass das Virus gefährlich ist. Gefährliche Viren sind theoretisch möglich, erfordern aber weitaus mehr Rekombinationen als die minimalen 2 für die Replikationskompetenz in Lentivektorsystemen der 2. Generation.

Beispielsweise codieren Lentivektorsysteme im Allgemeinen nicht für die viralen Proteine ​​vpr, vif, nef und vpu . Diese Proteine ​​sind notwendig, um die Infektiosität von HIV in verschiedenen Gewebetypen zu erhöhen (jedoch nicht in kultivierten Zellen wie HEK293). Das Fehlen dieser Proteine ​​in einem hypothetischen replikationsfähigen Lentivektor würde seine Ausbreitung in freier Wildbahn erheblich behindern. Der Einbau dieser Proteine ​​ist plausibel, aber äußerst unwahrscheinlich, da mehr Crossover-Rekombinationsereignisse erforderlich sein werden.

Um Ihr Beispiel zu verwenden, befindet sich das env- Protein, das für die VSV-Proteinhülle kodiert, im Hüllplasmid. Da der replikationskompetente Lentivektor, der durch 2 Rekombinationsereignisse gebildet wird, ein Pseudotyp sein wird , der nur die HIV- env- Proteine ​​enthält, muss er weiter das VSV-Gen erwerben, um seine env- Proteine ​​zu ersetzen, da diese Gene nicht in denselben Regionen vorhanden sind. Es besteht keine Homologie zwischen den beiden DNA-Strängen, was die Wahrscheinlichkeit erheblich beeinträchtigen würde, dass das VSV-Gen irgendwie in aktives HIV eingebaut wird.

Die Hinzufügung verschiedener chimärer Proteine ​​und LTR-Regionen in Lentivektoren der 3. Generation verkompliziert die Sache nur.

Insgesamt konnte ich keine Quellen finden, die die Infektiosität dieser theoretischen transgenen HIV mit der des Wildtyps vergleichen. Obwohl es theoretisch möglich ist, dass ein transgener replikationskompetenter Lentivektor durch den Erwerb des VSV-Gens einen besseren Tropismus als HIV aufweisen kann, ist die Wahrscheinlichkeit, dass dies eintritt, weitaus geringer als die, dass er überhaupt produziert wird.

Kann ein Lentivektor durch einen HIV-Test nachgewiesen werden?

Bezüglich der abschließenden Frage, ob ein Lentivektor durch einen Standard-HIV-Test nachgewiesen werden kann, lautet die Antwort, dass der Nachweis möglich ist, wenn die Person, die mit Lentivektoren infiziert wurde, eine Immunantwort auf die Lentivektor-gag-Proteine ​​erhalten hat und die Lentivektor-Belastung erfolgt hoch genug.

HIV-Tests sind spezifisch für verschiedene Teile des Virus, aber die meisten von ihnen zielen auf das virale Protein p24 ab , das eine Komponente des gag- Polyproteins ist.

Es gibt auch PCR-basierte HIV-Tests, aber diese Tests hängen von den spezifischen produzierten Primern ab und davon, ob die RT-PCR angesichts der spezifischen Sequenz der Plasmide ein Amplicon produzieren würde.

Da gag-Gene in den meisten Lentivektor-Systemen kodiert sind , ist es daher sehr wahrscheinlich, dass jeder, der mit einem Lentivektor infiziert ist, Antikörper gegen p24 exprimieren und daher sowohl im ELISA als auch im Western-Blot-Test positiv ausfallen würde, vorausgesetzt, dass p24 und Antikörpermengen sind hoch genug, um den Grenzwert zu erreichen.

Ich war nicht in der Lage, öffentlich verfügbare Grenzwerte für die ELISA- und Western-Blot-Werte zu finden, aber wenn (hypothetisch gesprochen) einer Person eine Ladung Lentivektoren injiziert würde, würde sie wahrscheinlich positiv auf HIV getestet werden. Da sich der Lentivektor jedoch nicht aktiv reproduziert, würde er schnell vom Immunsystem beseitigt werden.

Ist es aus Ihrer Antwort richtig zu glauben, dass HIV1 vom Wildtyp vorhanden sein MUSS? denn wenn ja, dann kann ich mir natürlich vorstellen, dass es überhaupt nicht gut ist, aber wenn Sie bereits HIV haben, ist es vielleicht nicht so "wichtig"? Ich fragte nach der Möglichkeit, unter den Bedingungen, unter denen Lentivektoren produziert werden, replikationsfähige Viren zu bilden> 293T-Zellen mit den Plasmiden zu transfizieren, die meiner Meinung nach keine HIV-Sequenzen enthalten.
Zusätzlich gibt es eine dritte Frage im Text, die nicht irgendwie hervorgehoben wurde, sich aber auf die Infizierbarkeit und den Krankheitsverlauf bezieht, die dieser theoretische Virus haben könnte
Aktualisiert, um einige Probleme zu klären, insbesondere die fehlerhafte Beschreibung des Vektors im VCU-Artikel @Katz
kann dadurch keine nicht-homologe Rekombination zwischen den transfizierten Verpackungs-/Hüllen-/Konstruktionsplasmiden stattfinden, um ein replikationsfähiges Virus ohne vorhandene HIV-Sequenz zu erzeugen? Ich würde Ja sagen. Vorfall? und die Immunantwort für das VSV/G-umhüllte rekombinante Virus? kann das VSV/G-Protein als Antigen wirken? würde es ausreichen, um eine Pathologie zu verhindern?
@Katz Gemäß den Plasmidkarten scheint in keinem der Plasmide der 2. oder 3. Generation ein Wildtyp-3'-LTR vorhanden zu sein, sodass selbst eine nicht-homologe Rekombination nicht zur Produktion von Viren führt. Bei gesunden Personen gibt es keinen Grund, warum das VSV-Protein nicht angegriffen wird, da es sich eindeutig um nicht-eigene virale Proteine ​​handelt.
Entschuldigen Sie die erneute Eröffnung, aber könnten Sie spezifizieren, welche Funktionen der HIV 3 LTR hat und welche möglichen Auswirkungen diese in den Lentivektoren gefundenen Deletionen auf mechanistische Weise auf den Viruslebenszyklus haben könnten? Ich eröffne dies erneut, weil ich herausgefunden habe, dass LTRs als regulatorische Sequenzen fungieren, insbesondere 3LTR bei der Polyadenilierung, aber die Gene in den Lentivektorsystemen WERDEN tatsächlich exprimiert, und das Insert-Gen, das normalerweise zwischen die LTR geht, soll funktionieren, das ist der springende Punkt. also frage ich mich wirklich, wie fatal das wirklich ist.
@Katz Die Gene im Lentivektor werden nicht vom LTR-Promotor exprimiert, sondern vom Gen-eigenen Promotor. Die verkürzte LTR verhindert die Transkription der gesamten Sequenz einschließlich der LTRs.
Ich habe einige Nachforschungen angestellt und festgestellt, dass der Wirkungsmechanismus des verkürzten 3LTR darin besteht, dass es das erzeugt, was in der Literatur als „Selbstinaktivierung“ bezeichnet wird. Doch nachdem ich die Papiere gelesen habe, bekomme ich den implizierten Mechanismus immer noch nicht zum Laufen, ich glaube, ich verpasse möglicherweise einen wichtigen Teil der LTR-Biologie und der Rolle, die sie spielt.
@Katz pnas.org/content/83/10/3194.full.pdf scheint den Mechanismus ziemlich klar zu beschreiben.
ok, der Trick war der RT-Mechanismus, der springend arbeitet
Da die retroviralen LTRs jedoch beide identisch sind, könnte ich das Argument der Rekombination vorbringen und sagen, dass die 3LTR mit einem korrekten rekombinieren könnte. Außerdem kann ich vermuten, dass die Homologien dieses Mal tatsächlich dienen könnten.
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