Jedes verdammte Protokoll schlägt vor, bei der In-vitro -RNA-Transkription DTT hinzuzufügen . Wieso den? Die Begründung scheint zu sein, dass das Zytoplasma traditionell eine reduzierende Umgebung hat, aber da das einzige Protein, das uns interessiert, die T7-Polymerase ist, warum ist dies notwendig?
Eine schnelle Suche nach T7-Cysteinen gab einige Hinweise:
Bakteriophagen-T7-induzierte DNA-Polymerase besteht aus einem 1:1-Komplex aus Phagen-induziertem Gen-5-Protein und Escherichia coli-Thioredoxin. Die Herstellung aktiver Untereinheiten in Abwesenheit von Sulfhydrylreagenzien zeigt an, dass die reduzierte Form von Thioredoxin für die Bildung des aktiven Holoenzyms ausreichend ist. Die oxidierte Form von Thioredoxin, Thioredoxin modifiziert an einem Sulfhydryl der aktiven Stelle durch Iodacetat oder Methyliodid oder Thioredoxin modifiziert an beiden Sulfhydrylen der aktiven Stelle durch N-Ethylmaleimid sind alle inaktiv, da sie bei der Komplexbildung mit Gen-5-Protein defekt sind.
Adler und Modrich, J. Biol. Chem. 258: 6956 (1983)
Es gibt eine neuere Veröffentlichung ( Aguirre et al, Inorganic Chemistry 48:4425 (2009) ), in der die „ enzymkritischen Sulfhydryl-Cystein-Gruppen “ erwähnt werden, aber leider habe ich nur Zugriff auf die Zusammenfassung.
Update : Es scheint eher ein alter Befund als eine Begründung für den zytoplasmatischen Redoxzustand zu sein. Laut Chamberlin und Ring, JBC 248:2235 (1973) ,
Allgemeine Erfordernisse – Die allgemeinen Erfordernisse für die durch T7-DNA-Polymerase gesteuerte T7-RNA-Synthese sind in Tabelle I gezeigt. Wie für eine matrizengesteuerte Polymerase erwartet, zeigt die RNA-Synthese einen absoluten Bedarf an DNA, den 4 Ribonukleosidtriphosphaten und Mg++.
(keine Überraschungen dort ;)
Die Aktivität des Enzyms wird signifikant verringert, wenn ein Sulfhydryl-Reduktionsmittel wie b-Mercaptoethanol aus der Reaktion weggelassen wird. Die Zugabe von 10^-5 M p-Hydroxymercuribenzoat zu dem Testsystem in Abwesenheit von b-Mercaptoethanol beseitigte jegliche Aktivität, was anzeigt, dass das Enzym eine für die Aktivität notwendige Sulfhydrylgruppe enthält.
Wenn Sie jedoch Tabelle I sehen, beträgt die verbleibende Aktivität nach dem Entfernen von bme immer noch 74 %.
Es scheint 7 exponierte Cysteine zu geben ( Mukherjee et al, Cell 110:81 (2002) ), aber ich konnte keine Veröffentlichung finden, die ihre Rolle diskutiert.
Ich habe immer angenommen, dass dies daran liegt, dass DTT bei der Inaktivierung von Ribonukleasen (durch Reduktion ihrer Disulfide) nützlich ist, die notorisch stabil und allgegenwärtig sind. Es wäre ziemlich unglücklich, Ihre RNA synthetisieren zu lassen, nur um sie sofort von einer kontaminierenden RNase zerstören zu lassen.
Benutzer560