Ich wäre dankbar, wenn mir jemand einen Link zu einem Artikel oder einer Enzyklopädie/einem Handbuch schicken würde, die eine Erklärung des Konzepts der enzymatischen Aktivität enthält. Überraschenderweise gelang es mir nicht, etwas anderes als eine kurze Definition zu finden.
Eine Einführung in Enzyme (pdf) finden Sie hier .
Auszug aus einer sehr beliebten Worthington-Publikation, die ursprünglich 1972 als Manual of Clinical Enzyme Measurements veröffentlicht wurde. Während einige der Präsentation etwas veraltet erscheinen mögen, sind die grundlegenden Konzepte dennoch hilfreich für Forscher, die Enzyme verwenden müssen, aber wenig Hintergrundwissen in Enzymologie haben .
Quelle: Worthington Biochemical Corporation.
Die Menge oder Konzentration eines Enzyms kann als Aktivität in Enzymeinheiten ausgedrückt werden. Siehe Wikipedia :
Enzymaktivität = Mol Substrat, umgewandelt pro Zeiteinheit = Geschwindigkeit × Reaktionsvolumen. Die Enzymaktivität ist ein Maß für die Menge des vorhandenen aktiven Enzyms und hängt somit von Bedingungen ab, die spezifiziert werden sollten. Die SI-Einheit ist das Katal, 1 Katal = 1 mol s−1, aber das ist eine zu große Einheit. Ein praktischerer und gebräuchlicherer Wert ist Enzymeinheit (U) = 1 μmol min−1. 1 U entspricht 16,67 Nanokatals.
Hier sind einige zusätzliche nützliche, einfache Videos, die die Enzymaktivität erklären:
Der Eintrag für Enzyme in Wikipedia enthält 28 Vorkommen des Wortes „Aktivität“. Ich kann daher nur vermuten, dass die Tatsache, dass dieser Begriff nicht explizit definiert ist, das Problem ist – eines, für das sich ein Neuling auf dem Gebiet nicht entschuldigen muss. Ich werde darauf in elementaren – aber nicht selbstverständlichen – Begriffen antworten.
Enzyme sind biologische Katalysatoren, daher ist die Katalyse ihre grundlegende Eigenschaft oder Qualität. In diesem Zusammenhang lautet meine Definition:
Enzymaktivität ist die Manifestation der katalytischen Fähigkeit eines Enzyms
Meine Verwendung des Wortes „Manifestation“ ist absichtlich und wichtig: Das Wesen der Enzymaktivität ist die Wirkung oder Funktionsweise des Enzyms, weil wir uns auf diese Weise seiner Anwesenheit bewusst sind und somit quantitative oder qualitative Schlussfolgerungen ziehen über sein Verhalten oder seine Funktion.
Nachweis der Enzymaktivität
Die Enzymaktivität wird nachgewiesen, indem eine Reaktion beobachtet wird, die es katalysiert, dh indem die Umwandlung eines chemischen Reaktanten (als Substrat des Enzyms bezeichnet) in ein Produkt beobachtet – und normalerweise gemessen – wird. Damit können bestimmte Fragen beantwortet werden:
1. Ist das Enzym vorhanden oder nicht, oder kann es, falls vorhanden, sein Potenzial entfalten?
Die grundlegendste Frage, zu deren Beantwortung die Messung der Enzymaktivität verwendet wird, ist, ob ein Enzym vorhanden ist oder nicht, zB in einem Gewebe. Tatsächlich kann das Fehlen von Enzymaktivität neben dem Fehlen von Enzymprotein auch andere Interpretationen haben: Das Enzym könnte vorhanden, aber denaturiert oder vergiftet sein, oder es könnte aufgrund des Fehlens eines sekundären Agens (Cofaktor, Regulator) in einer inaktiven Form vorhanden sein Molekül), das für seine Funktion erforderlich ist.
2. Wie viel Enzym ist vorhanden?
Bei experimentellen Arbeiten, bei denen man die Mengen eines Enzyms in verschiedenen Geweben vergleichen, seine Reinigung von anderen Proteinen überwachen oder die Auswirkungen von Wirkstoffen und Bedingungen auf seine Funktion untersuchen möchte, muss man es nicht nur nachweisen (z. B. indem man beobachtet, dass eine farbige Substanz gebildet wird), sondern um zu messen, wie viel Enzym oder funktionierendes Enzym vorhanden ist. Um die Enzymaktivität zu quantifizieren, messen wir die Menge an Substrat, die in einer bestimmten Zeit unter geeigneten Bedingungen in Produkt umgewandelt wird.
Erläuterungen zu den verwendeten Einheiten und den geeigneten Bedingungen sind in Standardtexten und im Internet verfügbar. Mein eigenes Selbstlernmaterial zu diesem Thema finden Sie hier .
3. Was ist die Natur der katalysierten Reaktion oder gibt es dort mehr als ein Enzym?
Dies sind weitere Fragen, die die Messung der Aktivität eines Enzyms oder eines unreinen Präparats beantworten kann. Wichtig ist hier, welche Reaktion genau katalysiert wird. Wenn ein Enzym die Phosphorylierung von D-Glucose zu Glucose-6-Phosphat katalysieren kann, kann es dann auch die Phosphorylierung von L-Glucose katalysieren – dh ist es spezifisch für ein Rotamer? Wenn das Präparat z. B. auch Fruktose phosphorylieren kann, sind dann tatsächlich zwei verschiedene Enzyme im Präparat vorhanden? Wenn es einen anderen Zucker 50-mal besser phosphoryliert als Glucose, ist seine Funktion in der Zelle vielleicht anders als bisher angenommen.
Aktivität als allgemeiner Begriff in Naturwissenschaften und Biologie
Die Messung der Aktivität statt der Menge ist nicht auf Enzyme beschränkt. Man beschäftigt sich auch mit der Aktivität von Hormonen , Medikamenten , Neurotransmittern etc. (z. B. um festzustellen, auf welche Gewebe sie wirken und welche Wirkung sie haben). Und allgemeiner leiten wir in der Wissenschaft die Existenz von Dingen aus ihrer Fähigkeit ab, etwas zu tun – die Schwerkraft ist ein Beispiel aus der Physik.
Die Enzymaktivität bezieht sich auf den dynamischen Prozess eines Enzyms, das eine Reaktion katalysiert, und ist ein Maß für die Menge an katalytisch kompetentem Enzym, das in einer Zubereitung vorhanden ist.
Wir messen die Enzymaktivität, indem wir einen Versuch mit der Enzymreaktion machen, d. h. wir testen das Enzym. Der Versuch oder Assay wird in erster Linie unter Bedingungen durchgeführt, unter denen das Enzym wirkt. Der pH-Wert kann zum Beispiel von entscheidender Bedeutung sein, ebenso wie die Anwesenheit oder Abwesenheit von Inhibitoren oder Aktivatoren. Außerdem wird der Assay unter Bedingungen durchgeführt, bei denen der Experimentator die katalytische Umwandlung direkt oder indirekt nachweisen kann, vielleicht durch Überwachung der Produktion eines Produkts oder des Verbrauchs eines Substrats.
Wenn ich zum Beispiel die Aktivität einer Dehydrogenase messen möchte, könnte ich die Abnahme der Absorption bei 340 nm messen, wo NADH, aber nicht NAD(+) stark absorbiert. In einem Spektrophotometer kann dies kontinuierlich mit der Zeit erfolgen und ist ein Beispiel für einen kontinuierlichen Assay.
Es kann jedoch keine zweckmäßige Änderung der Extinktion geben, aber wir könnten ein radioaktives Substrat haben. In diesem Fall könnten wir unseren Versuch unter Bedingungen durchführen, bei denen wir erwarten würden, dass das Enzym beispielsweise 30 Minuten arbeitet, die Reaktion stoppt (z. B. durch Denaturierung des Enzyms mit Säure) und ein radioaktives Produkt isoliert . Dies wäre ein Beispiel für einen diskontinuierlichen Assay.
In beiden Fällen beobachten wir eine Veränderung aufgrund des Enzyms, das eine bestimmte Reaktion katalysiert, dh wir messen die Enzymaktivität.
Wir kommen nun zu einer wichtigen Unterscheidung. Ein Enzymassay ist ein Maß für die katalytische Aktivität, die mit der Gesamtmenge an vorhandenem Enzymprotein in Beziehung stehen kann oder nicht. Stellen Sie sich eine genetische Krankheit vor, die dazu führt, dass eine bestimmte Enzymaktivität in einem Organ vollständig fehlt. Wir untersuchen beispielsweise eine Leberprobe auf Laktatdehydrogenase und finden keine vor (um ein triviales Beispiel zu nennen). Dies könnte bedeuten, dass das Enzym nicht produziert wird: Es ist kein Enzym vorhanden. Es könnte aber auch bedeuten, dass das Enzym vorhanden ist, aber in einem inaktiven Zustand produziert wird. Vielleicht hat das „normale“ Enzym ein essentielles Tyrosin an der aktiven Stelle, aber eine genetische Mutation hat dieses in dem untersuchten Fall zu einem Phenylalanin verändert.
Wenn wir einen Antikörper haben, der gegen das untersuchte Enzym gerichtet ist, könnten wir einen enzymgebundenen Immunoassay (ELISA) entwickeln, der ( wenn er gut ist) spezifisch die Gesamtmenge des vorhandenen Proteins misst, ob aktiv oder nicht , sogar in einer rohen Leber Extrakt. (Ein Western Blot könnte natürlich auch das Vorhandensein von inaktivem Protein nachweisen). Das heißt, ein Enzymassay gibt eine Schätzung der vorhandenen Enzymmenge basierend auf der Enzymaktivität , während ein ELISA eine Schätzung der Gesamtmenge des vorhandenen Enzymproteins liefert.
Die Enzymaktivität wird üblicherweise in Form der pro Minute oder pro Sekunde umgewandelten Substrat- oder Produktmenge angegeben: beispielsweise in Mikromol/min. Es ist auch üblich, die Gesamtmenge an vorhandenem Protein zu messen und die Enzymaktivität in Mikromol/min pro Milligramm (Gesamt-)Protein anzugeben. Dies ist die spezifische Aktivität und ermöglicht einen einfachen Vergleich. Fast ausnahmslos bezieht sich der „pro Milligramm“-Teil einer spezifischen Aktivitätsmessung auf die Gesamtmenge an vorhandenem Protein (gemessen mit dem Lowry-Proteinassay oder ähnlichem).
(Wenn beispielsweise Labor A berichtet, dass 20 Mikroliter seines Leberextrakts eine a-Dehydrogenase-Aktivität von 5 Mikromol/min aufweisen, und Labor B berichtet, dass 20 Mikroliter seines Leberextrakts eine a-Dehydrogenase-Aktivität von 50 Mikromol/min aufweisen, sind diese Messungen auf Proteinbasis (Mikromol/min pro mg) durchaus identisch sein können und dass der einzige Unterschied darin besteht, dass Leber A in 100 Volumina Puffer extrahiert wurde, Leber B jedoch in 10 Volumina Puffer extrahiert wurde).
Einheiten der Enzymaktivität beziehen sich ausnahmslos auf spezifische Testbedingungen, und dies kann eine sehr wichtige Überlegung bei der Planung eines Experiments sein. Außerdem sind Enzyme labil und die Aktivität kann mit der Zeit abnehmen (z. B. bei längerer Lagerung). Wenn zum Beispiel ein Protokoll erfordert, dass Sie 10 mg eines Enzympräparats mit einer spezifischen Aktivität von 100 Einheiten/mg (100 Mikromol/min pro mg) hinzufügen, das Einfrieren des Enzympräparats jedoch zu einer Denaturierung geführt hat, fügen Sie 10 mg hinzu Enzymprotein, aber keine Enzymaktivität . Dies kann auch wichtig sein.
Zum Schluss noch ein toller Hinweis:
Prinzipien des Enzymassays und kinetische Studien von KF Tipton in Enzyme Assays: A Practical Approach
Roland
David