Ich bin ausgebildeter Physiker, bitte entschuldigen Sie, wenn ich nicht die richtige Terminologie verwende.
Ich denke, es gibt eine Möglichkeit, einen Sensor herzustellen, der erkennt, ob ein einzelner Antikörper etwas aus dem Fluss gefangen hat. Ich versuche also herauszufinden, ob dies ein nützlicher Sensor wäre, aber das hängt davon ab, wie spezifisch die Antikörper wirklich sind.
Wenn ich Biologen frage "Wie spezifisch sind Antikörper?", antworten sie: "Sehr, sehr spezifisch", liefern aber keine Werte, die ich auf mikroskopischer Ebene verstehe. Ich versuche aber eine quantitative Abschätzung vorzunehmen, zB für folgendes Gedankenexperiment:
Angenommen, ich habe einen Antikörper an eine anorganische Oberfläche gebunden. Es ist ein Antikörper zum Einfangen von Objekt X. Und ich lasse langsam Blut über die Oberfläche fließen. Angenommen, es gibt überhaupt kein X in diesem Blut. Aber jede Sekunde strömen jede Menge (vielleicht 10 17 , oder so eine verrückte Zahl) anderer Streupartikel an diesem Antikörper vorbei, richtig? Wenn also eines dieser Partikel auf diesen einen Antikörper trifft, wie groß ist die Wahrscheinlichkeit, dass es an diesem Antikörper haften bleibt? Ist es wirklich 10 -17 ? Ist es wirklich so klein?
Und überhaupt, wie schätze ich diese Wahrscheinlichkeit auf mindestens 1-2 Größenordnungen?
Wie schätze ich auch die "Kollisionsquerschnittsfläche", durch die ein Objekt fliegen muss, um einen Versuch zu unternehmen, an einen Antikörper zu binden? Mit anderen Worten, muss es ihn nur leicht berühren oder bei einer harten und chaotischen Kollision mit einem Antikörper kollidieren?
Hängt die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Bindung von der Strömungsgeschwindigkeit ab?
Wie würden sich die Werte verändern, wenn ich statt Blut Serum nehme?
Könnten Sie bitte auf einige relevante Artikel, Bücher oder einfach nur Schlüsselwörter verweisen? Ich würde mich sehr über jede Hilfe freuen.
TL;DR Die Spezifität des Antikörpers kann nicht hervorragend sein. Es kann in bis zu 90 % der Experimente falsch-positive Ergebnisse liefern. Einige Aufsätze sind jedoch zu 90 % spezifisch.
Das ist eine interessante Frage, und es wurde sicherlich viel geforscht, um die Spezifität und Stärke der Bindung des Antikörpers an sein Ziel zu verstehen.
Lassen Sie mich zunächst sagen, dass die Antikörper-Epitop-Wechselwirkung, wie viele biologische Prozesse, ein probabilistischer Prozess ist, was bedeutet, dass es in beide Richtungen gehen kann, aber nach der Bindung benötigen die Antikörper viel mehr Energie oder Zeit, um "abzufallen". Für den Aufbau einer nicht-kovalenten Bindung zwischen Antikörper und Epitop ist immer ein direkter Kontakt erforderlich, da die charakteristische Länge dieser Wechselwirkung sehr gering ist (Größenordnung oder Angström, 0,1 nm und weniger). Der Punkt hier ist, dass Sie den Antikörper nicht im Strom laufen lassen müssen, sondern ihn in Lösung mit Ihrer Probe sitzen lassen oder vorsichtig mischen, zufällige thermische Bewegung sorgt dafür, dass sie sich finden. Im Flow verschwenden Sie viel Antikörper, was teuer ist.
Ich denke, dass Sie die Wahrscheinlichkeit der Bindung eines bestimmten Antikörpers an ein bestimmtes Molekül anhand ihrer 3D-Strukturen abschätzen können, aber dies ist eine äußerst mühsame Berechnung. Was Sie experimentell tun können, nehme ich an, ist das "richtige" Epitop mit einem roten fluoreszierenden Tag und jedes andere Molekül in Ihrer Lösung mit einem grünen Tag zu markieren. Dann die Lösung durch die Säule laufen lassen, wobei der Antikörper auf Kügelchen sitzt (wie bei der Chromatographie), alles eluieren und das grüne mit dem roten Signal vergleichen. Wenn Sie genau messen, erfahren Sie, wie viel "Müll"-Antikörper aus der Lösung herausgepickt wurde.
Nun zu den Zahlen. Hier spricht Abcam über seinen Antikörper für Progesteron. Moleküle, die eng mit Progesteron verwandt sind, werden mit einer Effizienz von 40–90 % erkannt, verglichen mit einem richtig positiven Ziel (Progesteron). Aber das ist das absolute Worst-Case-Szenario, weil diese Moleküle so eng miteinander verwandt sind.
Andererseits ist die Antikörperspezifität sehr wichtig, wenn Aufsätze verwendet werden, zB für die HIV-Diagnose. Hier ist eine nette Seite von U Penn, die Probleme mit Spezifität diskutiert:
Beispielsweise betrug in einer Studie mit 290.000 asymptomatischen Blutspendern aus Minnesota, die 630.000 Bluteinheiten spendeten, die falsch positive Rate, wenn sowohl der Screening- als auch der Bestätigungsassay positiv waren, 0 % pro Spende (95 % Konfidenzintervall 0 % bis 0,0006 %).
...
Beispielsweise wurde in einer Studie mit asymptomatischen italienischen Blutspendern nur etwa 13 % der Spender mit wiederholt reaktiven EIA-Tests auf der Grundlage eines positiven Immunoblots als HIV-infiziert bestätigt. In einer Hochrisikopopulation kann die Falsch-Positiv-Rate jedoch viel niedriger sein und nur 1-3 % betragen.
Genauere Daten oder Studien konnte ich nicht finden. In der biologischen Bildgebung (mein Bereich) werden Antikörper in "funktioniert" und "funktioniert nicht, lass es fallen" (auch bekannt als hoher Hintergrund) Gruppen aufgeteilt.
Stellen Sie klar, wenn Sie "Antikörper" sagen, meinen Sie einen monoklonalen Antikörper (bei dem jeder Antikörper identisch ist und daher eine reine Population) oder meinen Sie einen polyklonalen Antikörper (das ist eine Mischung von Antikörpern, die alle dasselbe Antigen erkennen, aber kann jeder unterschiedliche Epitope auf dem Antigen erkennen)? Ein monoklonaler Ab (mAb) erkennt ein einzelnes Epitop.
Lehrbücher und Lieferantenkataloge tun oft so, als ob die Ak-Bindung absolut ist, als ob Sie die drei Größen nicht messen könnten: molare Konzentration des freien Antigens, molare Konzentration des freien mAb und molare Konzentration des gebundenen Antikörper-Antigen-Komplexes. Mit anderen Worten, als ob jeder Antikörper die ganze Zeit voll besetzt wäre, sobald der Ab auf ein Molekül freies Antigen trifft. Aber ich denke, Sie können aus den Diskussionen und Antworten oben erkennen, dass nicht alle Ab gleich geschaffen sind.
In Fällen, in denen Menschen diese Kd (die Dissoziationskonstante) für einen "fest" bindenden Antikörper gemessen haben, liegt der Wert in der Größenordnung von 10EE-14 oder kleiner (soweit ich mich erinnere). Wenn wir von fester Bindung sprechen, meinen wir normalerweise, dass die sogenannte Off-Rate sehr langsam ist, mit einer t1/2 in der Größenordnung von Stunden. In einer typischen Reaktion ist die On-Rate normalerweise durch die Diffusionsrate begrenzt und kann nicht schneller sein (aber suchen Sie nach Diskussionen über das lac-Repressor-DNA-bindende Protein, das seine Ziele mit einer Kinetik findet, die schneller als die Diffusionsrate ist!)
Das von Ihnen beschriebene Gerät (das Bindungsereignisse unter Verwendung von fixierten Proteinen auf einer Oberfläche und Zielproteinen in Lösung erkennt) misst die Oberflächenplasmonenresonanz und war zu einem bestimmten Zeitpunkt unter dem damaligen Markennamen BIAcore erhältlich. Es wurde von Mel Simon am CalTech entwickelt.
Wenn Ihr Ziel schließlich eine automatisierte Methode zur Verwendung von Antikörperreagenzien zum Nachweis verschwindend geringer Antigenmengen in einem komplexen Flüssigkeitsgemisch ist, sollten Sie sich mit dem Radioimmunoassay (RIA) vertraut machen, da dieser außerordentlich empfindlich sein kann. Denken Sie daran, dass all diese unterschiedlichen Techniken eine untere Nachweisgrenze haben, sodass ein negatives Ergebnis („Wir konnten kein Protein X in der Probe dieses Patienten messen“) immer mit der Maßgabe in Betracht gezogen werden muss, „zu verwenden diesem speziellen Nachweisassay". Es ist also eine Art Konfidenzniveau.
PinkyL
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