Welche Rolle spielen Guanidin-HCl und Ethanol bei der Bindung von DNA an Silica?

Ich versuche zu verstehen, wie genau der Schritt der Bindung an Kieselgel (in Kits) funktioniert, und ich kann keine Papiere finden, die eine Erklärung der Physik oder Chemie enthalten. vor allem auf die Art und Weise, wie Guanidin-HCl wirkt.

Also lasst sie uns von Anfang an holen.

Zunächst stellen wir die DNA-Bindungsbedingungen ein, indem wir einen Puffer hinzufügen, der Guanidin-HCl und Ethanol enthält, und dann zentrifugieren wir unsere Probe. Ich wusste, dass Guanidin-HCl die Tertiärstruktur von Proteinen zerstört, aber irgendwo habe ich gelesen, dass es auch der DNA hilft, an eine Silicasäule zu binden. Ich habe gesucht, um herauszufinden, wie es funktioniert, aber ich konnte kein Papier finden. Welche Rolle spielt Ethanol in diesem Schritt? Geht es nur darum, Proteine ​​und Polysaccharide aus der Probe zu entfernen?

Eine ausgezeichnete Diskussion darüber findet sich in: Melzak et al. (1996) Treibende Kräfte für die DNA-Adsorption an Silica in Perchloratlösungen. J. Colloid Interface Sci. 181: 635 - 644 Ich habe die Arbeit überflogen und fange an, sie zu verstehen, aber ich fühle mich noch nicht in der Lage, die Frage tatsächlich zu beantworten.
Die ganze Geschichte, wie ich sie verstanden habe, ist also überhaupt nicht klar. Hier ist eine Zusammenfassung dessen, was ich bekommen habe, aber ich bin mir nicht sicher, ob dies die endgültige Antwort ist. In früheren Jahren gab es die Meinung, dass die SiO4-Moleküle ebenso wie die DNA negativ geladen sind. Um die Bindung zu erreichen, mussten Sie also eine hohe Konzentration verwenden. Salz (chaotropes Salz) und alkalischer pH. Auf diese Weise bilden einige Kationen aus dem Salz eine Brücke zwischen DNA und SiO4-Molekülen. In neueren Studien (Wasserinteraktionen mit Silikaoberflächen: Eine große Rolle für die Oberflächenstruktur) scheint es, dass die Dinge nicht so funktionieren. Sie sagen voraus, dass SiO4-Moleküle hat
(Fortsetzung von oben) positive Ladungen und die Wirkungsweise dieses chaotropen Mittels besteht darin, eine hydrophobe Umgebung zu schaffen, um die Wassermoleküle von der DNA zu entfernen und sie an die Silikamembran binden zu lassen. Was Ethanol angeht ... noch nichts. Einige Unternehmen erklären dennoch den Bindungsmechanismus, wie ich ihn zuerst beschrieben habe.
Soweit ich weiß, ist das Ethanol nur eine Wäsche, in der DNA unlöslich ist, um Verunreinigungen zu entfernen

Antworten (1)

Guanidin-HCl ist ein chaotropes Salz . Chaotrope Salze sind entscheidend für die Zelllyse und die Bindung an das Silikaharz. Insbesondere haben Chaotrope zwei wichtige Rollen bei der Nukleinsäureextraktion

  1. Destabilisieren Sie Wasserstoffbrückenbindungen, Van-der-Waals-Kräfte und hydrophobe Wechselwirkungen.

    • Führt zur Destabilisierung von Proteinen (einschließlich Nukleasen).

      Die makromolekulare Struktur und Funktion hängt von der Nettowirkung dieser Kräfte ab (siehe Proteinfaltung), daher folgt daraus, dass eine Zunahme an chaotropen gelösten Stoffen in einem biologischen System Makromoleküle denaturiert, die enzymatische Aktivität verringert und eine Zelle (d. h. eine Zelle) stresst müssen Stressschutzmittel synthetisieren). Tertiäre Proteinfaltung ist abhängig von hydrophoben Kräften von Aminosäuren in der gesamten Sequenz des Proteins. Chaotrope gelöste Stoffe verringern den hydrophoben Nettoeffekt hydrophober Bereiche aufgrund einer Fehlordnung von Wassermolekülen, die an das Protein angrenzen. Dadurch wird der hydrophobe Bereich in der Lösung solubilisiert, wodurch das Protein denaturiert wird. Dies gilt auch direkt für die hydrophobe Region in Lipiddoppelschichten; Wenn eine kritische Konzentration eines chaotropen gelösten Stoffes erreicht wird (im hydrophoben Bereich der Doppelschicht), wird die Membranintegrität beeinträchtigt und die Zelle lysiert. [Quelle ]

  2. Unterbrechen Sie die Assoziation von Nukleinsäuren mit Wasser.

    • Dadurch werden optimale Bedingungen für ihre Übertragung auf Kieselsäure geschaffen.

      Salze können chaotrope Eigenschaften haben, indem sie Ladungen abschirmen und die Stabilisierung von Salzbrücken verhindern. Wasserstoffbrückenbindungen sind in unpolaren Medien stärker, daher können Salze, die die chemische Polarität des Lösungsmittels erhöhen, auch Wasserstoffbrückenbindungen destabilisieren. Mechanistisch liegt dies daran, dass nicht genügend Wassermoleküle vorhanden sind, um die Ionen effektiv zu solvatisieren. Dies kann zu Ionen-Dipol-Wechselwirkungen zwischen den Salzen und Wasserstoffbindungsspezies führen, die günstiger sind als normale Wasserstoffbindungen. [ Quelle ]

Ethanol ist wie Guanidin-HCl ein chaotopisches Mittel . Ethanol wird aus 2 Gründen hinzugefügt:

  1. Verbessern und beeinflussen Sie die Bindung von Nukleinsäuren an das Silica.

    • Interferieren mit nicht-kovalenten intramolekularen Kräften wie oben beschrieben.

    • Reduzieren Sie die Assoziation von Nukleinsäuren mit Wasser. Von Melzak et al. (1996) :

      Die Verringerung der Wasseraktivität in Lösung durch Zugabe entweder eines chaotropen Salzes oder eines Alkohols verändert die helikale Struktur von B-DNA entweder kontinuierlich zu C-DNA oder durch einen scharfen kooperativen Übergang zu A-DNA (28). Jeder Übergang wird von einer Abnahme der für Lösungsmittel zugänglichen Oberfläche begleitet.

  2. Die richtige Konzentration ermöglicht das Auswaschen der Salze von der Membran. [ Quelle ].

Zitate

  • Melzaket al. (1996) Treibende Kräfte für die DNA-Adsorption an Silica in Perchloratlösungen. J. Colloid Interface Sci. 181: 635 - 644.
Welche Rolle spielen Guanidin-HCl und Ethanol bei der Bindung von DNA an Silica?
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