Welche strukturellen Faktoren beeinflussen die Km des Enzyms?

Gibt es Regeln (sollten nicht genau sein), um die kinetischen Änderungen in einem Enzym abzuschätzen, wenn ich daran eine Mutation vorgenommen habe?

Wenn ich die neuen kinetischen Werte nicht abschätzen kann, ist es möglich, die neue Kinetik nach der Mutation eines Enzyms in Abhängigkeit von der Punktmutation, die ich daran vorgenommen habe, zumindest zu klären oder eine Erklärung vorzuschlagen?

Ich möchte also die Änderungen der kinetischen Parameter (Km / Vmax) in meinem Enzym nach der Mutation erklären, vielleicht abhängig von der 3D-Struktur ? oder die Ladung/Größe der neuen Aminosäuren? Oder irgendwelche anderen Faktoren, die ich verwenden kann, um etwas Logisches vorzuschlagen, wie und warum diese Änderungen an meinem Enzym nach der Mutation passiert sind?

Ich brauche das für meine Dissertation und bin immer noch total ratlos, irgendwelche Ideen (mit den richtigen Referenzen) wären großartig. Ich schätze wirklich jede Hilfe.

Jede Mutation, die die Wechselwirkungen zwischen dem Enzym und den Substraten, Zwischenprodukten und Produkten beeinflusst, verändert das Verhalten des Enzyms. Ich schlage vor, einige Bücher und Artikel über Strukturbiologie zu lesen ... Nennen Sie es auch nicht strukturelle Faktoren, dieser Begriff wird bereits in der Kristallographie verwendet. Schließlich möchten Sie vielleicht Strukturbiologie als Tag hinzufügen und möglicherweise auch die Frage an der Chemiestapelbörse stellen.
Rechnerisch durch Molekulardynamik-Simulationen gekoppelt mit Berechnungen der freien Energie (auf Freie-Energie-Störung oder auf linearer Approximation basierende Methoden: lineare Reaktionsapproximation und lineare Wechselwirkungsenergie. Besuchen Sie PubMed und suchen Sie nach den relevanten Arbeiten von Arieh Warshel und Johan Aqvist. ncbi.nlm.nih .gov/pubmed

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Rechnerisch ist es unter Verwendung von Molekulardynamik(MD)-Simulationen schwierig, aber nicht unmöglich, die Wirkung von Mutationen auf freie Ligandenbindungsenergien und freie Aktivierungs- und Reaktionsenergien enzymatischer Reaktionen quantitativ zu reproduzieren. Die nützlichsten MD-Simulationsmethoden für einen solchen Zweck sind: Free Energy Perturbation (FEP), Linear Interaction Energy (LIE), Linear Response Approximation (LRA), Empirical Valence Bond EVB) und deren Kombinationen – entwickelt von Arieh Warshel ( Nobelpreis für Chemie 2013).

Mechanistisch beeinflussen Mutationen kurz- (van-der-Waals und elektrostatisch) und langreichweitige (elektrostatische) Wechselwirkungen mit der Umgebung, die den Rest des Proteins und das Lösungsmittel umfasst. Beachten Sie, dass freie Energie ein Attribut eines Ensembles ist, nicht einer einzelnen 3D-Struktur – weshalb es unwahrscheinlich ist, dass die Untersuchung einer einzelnen Struktur des mutierten Proteins die Wirkung der Mutation qualitativ aufdeckt, geschweige denn quantitativ. Man muss den Konformationsraum des Proteins abtasten – und die MD-Simulation ist die effizienteste Rechentechnik für eine solche Abtastung.

Zusammenfassend sind die Effekte einfach, aber das System ist äußerst komplex. . .

Klvana et al. (2012) Biochemistry 51: 8829-8843 .

Klvana et al. (2016) J. Phys. Chem. B120: 13017-13030 .

Ihre Frage ist nicht ganz klar: Wollen Sie die Wirkung von Mutationen vorhersagen? Oder möchten Sie experimentelle Kinetikdaten verstehen, indem Sie das Wildtyp-Enzym mit Punktmutanten vergleichen?

Um die Auswirkungen von Mutationen vorherzusagen, benötigen Sie idealerweise eine dreidimensionale Struktur des Enzyms im Komplex mit einem Substratanalogon. Gibt es eine solche Struktur in der PDB für Ihr Enzym? Dies würde Ihnen helfen, über die möglichen Auswirkungen von Punktmutationen nachzudenken. Wenn es keine solche Struktur gibt, können Sie sich nur auf Sequenzabgleiche (und möglicherweise Strukturen homologer Enzyme, falls sie gelöst wurden) verlassen, um herauszufinden, welche Reste für die Substratbindung und Katalyse wichtig sind.

K M hängt mit der Bindungsaffinität des Enzyms für sein Substrat zusammen. Jede Mutation, die beispielsweise eine H-Brücke zwischen dem Enzym und seinem Substrat unterbricht, würde also K M erhöhen .

Jede Mutation, die auf einen katalytischen Rest abzielt (z. B. eine als Säure-Base-Katalysator wirkende Aminosäureseitenkette), würde k cat (und daher auch V max ) beeinflussen und könnte es je nach Mutation größer oder kleiner machen.

Wenn Sie versuchen, experimentelle Kinetikdaten zu verstehen, fragen Sie sich, warum Sie sich überhaupt für diese Mutationen entschieden haben. Üblicherweise mutiert man Reste, um eine Hypothese zu testen. Oder versuchen Sie, die Auswirkungen natürlich vorkommender Mutationen zu verstehen?

do you want to predict the effect of mutationsJa. Is there such a structure in the PDBJa. any mutation that for example disrupts an H-bond between the enzyme and its substrate would increase KM.Warum? das ergibt für mich keinen sinn. Ohne auf eine Studie zu verweisen, die beweist, dass ich mich nicht darauf verlassen kann.
Km unterscheidet sich von Kd (siehe Lehrbücher für die genauen Definitionen und Bedeutungen beider), aber nahe genug, sodass wir Km ungefähr als die Bindungsaffinität für das Substrat betrachten können. Was verursacht Bindung? Nun, jede Wechselwirkung zwischen dem Enzym und dem Substrat, einschließlich H-Brücken, Salzbrücken, hydrophober Tasche auf dem Enzym, die den hydrophoben Teil des Substrats aufnehmen kann, usw. Die Unterbrechung einer dieser Wechselwirkungen führt zu einer schwächeren Bindungsaffinität, daher höher Kd- und Km- Werte.
In Bezug auf die verfügbare 3D-Struktur Ihres Enzyms: Haben Sie versucht, damit die möglichen Auswirkungen von Mutationen herauszufinden? Wenn ja, wie sind Sie vorgegangen und auf welche Schwierigkeiten sind Sie gestoßen? Ihnen zu helfen wäre einfacher, wenn Sie das sagen würden.
Mein Problem ist zu verstehen, wie diese von Ihnen erwähnten Faktoren (H-Bindungen, hydrophobe Taschen usw.) Vmax und Km unterschiedlich beeinflussen können. Eine engere Bindung (mehr Bindungen) zwischen Enzym und Substrat stabilisiert den Übergangszustand, und das erhöht die Vmax, aber ich kann nicht verstehen, wie unterschiedlich Km beeinflusst wird. Mit anderen Worten, ich kann nicht unterscheiden, welche Änderungen in der Struktur die Vmax und welche Km ändern können.
Nach meinem besten Wissen (ich bin kein Enzymologe) ist dies wirklich schwer vorherzusagen. Letztendlich müssen die Vorhersagen, die Sie aus einer Struktur machen, experimentell getestet werden. Die Struktur ist ein nützlicher Leitfaden, um die potenziell interessanten Mutationen auf nur wenige Reste einzugrenzen, da sie deutlich zeigt, welche nichts mit der katalytischen Stelle zu tun haben (dh die meisten von ihnen).
Hier kommt tatsächlich das Problem energetisch gekoppelter Reste (distaler Aminosäuren, können bei der katalytischen Aktivität eine Rolle spielen, auch wenn sie weit entfernt und für die 3D-Struktur nicht wichtig zu sein scheinen). In meiner Promotion. Dissertation habe ich das besprochen, aber das war wirklich nicht so einfach, und sie sind immer noch irgendwie nicht ganz klar.
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