Pektinase-Enzym-Assay

Ich arbeite an einem Pektinase-Enzym-Assay. Ich inkubierte 900 ul Substrat für 10 Minuten im Wasserbad, gefolgt von der Zugabe von 2 ml DNSA-Reagenz, dann wurden 100 ul Enzymextrakt hinzugefügt, schließlich las ich die Extinktion bei 540 OD ab. Allerdings sind die Werte hoch. Wie kann ich hohe Enzymblindwerte im Pektinase-Assay beheben?

Du hast also das Problem, dass dein Blank zu hoch ist?
Ja, der Enzymleerwert ist hoch
Können Sie eine Verunreinigung ausschließen?
Welche Schadstoffe? Die Enzymproduktion erfolgt so weit wie möglich in einer kontaminationsfreien Umgebung.
Sie führen diesen Assay nicht in Ihrer Hand durch, oder? Und was ist mit Ihren Reaktionsgefäßen, der Photometerküvette etc.?
Reaktionsgefäße und Küvette sind sauber
Verdünnen Sie die Standards so, dass die Werte im linearen Bereich und im hochpräzisen Bereich des Spektralphotometers liegen
Ich habe das Standardsubstrat auf 0,5 % w/v verdünnt, aber die Enzymleerwerte sind immer noch hochwertig,
Was ist das Substrat?
Pektin (Zitrus)
Ist der Enzymleerwert trüb/trüb?
Ja, es gibt eine Farbänderung zu hell bräunlich
Wenn der Leerwert überhaupt trüb oder gefärbt ist, sollten Sie ihn verwenden, um das Instrument zu kalibrieren/nullen (anstatt Wasser oder Puffer zu verwenden). Ist es das, was du tust?
Ich verwende den Reagenz-/Substratleerwert, um das Gerät zu kalibrieren

Antworten (1)

Ihr Rohling ist also alles außer dem Enzym? Dh Substrat und DNSA mit 100 µL Wasser? Wenn ja, messen Sie als Negativkontrollen Substrat allein und DNSA allein. Wenn einer von ihnen auch Licht stark absorbiert, kann er kontaminiert sein und ein neues Fläschchen sollte bestellt werden. Wenn beide stark absorbieren, kann es das verwendete Wasser oder das Spektralfotometer sein.

Alternativ können Sie versuchen, einen Zeitverlauf zu messen. Wenn die Extinktion des Blindwerts mit der Zeit zunimmt, liegt eine Kontamination vor, und eine Nachbestellung der Reagenzien kann Ihnen helfen. Wenn die Extinktion konstant bleibt, handelt es sich nicht um eine Enzymkontamination, d. h., der Übeltäter ist verdorbenes Wasser, eine fehlerhafte Spezifikation oder sogar ein falsches Protokoll. (Das heißt, eine Neuordnung oder Wiederholung hilft nicht.)

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