Ich sehe Zehntausende von PDB-Dateien im Internet. Ich möchte wirklich eine 3D-Struktur meines interessierenden Proteins bestimmen. Ich habe gehört, dass die 3D-Strukturbestimmung ein komplexes, teures und spezialisiertes Verfahren ist, das Monate oder Jahre dauern kann und schwer routinemäßig durchzuführen oder sogar kommerziell zu erwerben ist.
Können Sie bitte erklären, warum und wie schwer es ist? Was sind die Anforderungen und wie viel Budget wird normalerweise benötigt, um diese Art von Experiment durchzuführen?
Die experimentelle Bestimmung der Proteinstruktur ist schwierig: Die gebräuchlichste Methode ist die Röntgenkristallographie, die mit etwas Glück in wenigen Monaten durchgeführt werden kann und Jahre dauern kann, wenn Sie nicht Glück haben. Das Problem bei der Röntgenkristallographie ist, dass man gute Proteinkristalle braucht, und in den meisten Fällen kristallisieren Proteine nicht sehr gut, also braucht es viel Zeit (und viel gereinigtes Protein), um den richtigen Kristall zu bekommen. (Im Kommentarbereich fügte Cody einige gute Links mit tiefergehender Röntgenkristallographie zur Strukturbestimmung in Bezug auf ATP-Synthase hinzu).
Die Kosten basieren hauptsächlich auf den Materialien und Arbeitskräften, die Sie dafür benötigen, und Sie müssen viele verschiedene Lösungen testen, um Ihr Protein darin zu kristallisieren, die nicht sehr billig sind. Wenn Sie keinen Zugang zu spezialisierter Ausrüstung für die Herstellung der Kristalle (meistens Pipettierroboter) oder die Messung (Röntgen-Beamline) haben, wird dies sehr teuer.
Die Kristallographie erfordert Proteinkristalle, deren Gewinnung manchmal zu mühsam ist. Andere Methoden, die keine Kristalle erfordern, wie NMR und CryoEM, sind noch schwieriger durchzuführen, aber weniger glücksabhängig. Diese Techniken sind auf sehr teure Geräte angewiesen und können die Struktur oft nicht so genau auflösen wie die Proteinkristallographie. Wenn Sie also nicht einen der wenigen Leute finden, die Erfahrung mit diesen Methoden haben, werden Sie auf viele zusätzliche Probleme stoßen.
Es gibt auch eine rechnerische Strukturvorhersage, die nur einen leistungsstarken Computer benötigt. Wenn Ihr Protein jedoch einem Protein mit bekannter Struktur nicht sehr ähnlich ist, wird es wahrscheinlich nicht zuverlässig funktionieren. Wie in den Kommentaren erwähnt, gibt es Webserver für die etablierten Methoden und es werden ständig Fortschritte bei neuen(eren) Algorithmen gemacht, so dass es je nach Ihren Bedürfnissen auf jeden Fall einen Versuch wert ist, die Berechnungsstrukturvorhersage auszuprobieren.
Ich werde NMR zur Strukturbestimmung ansprechen. Es ist die weniger gebräuchliche Methode, nur ~10% der Proteinstrukturen werden auf diese Weise bestimmt, obwohl es zB Vorteile für Nukleinsäuren hat und mehr als ein Drittel davon durch NMR gelöst wurde. Nehmen Sie alle Zahlen hier als sehr grobe Schätzungen, es gibt viele Faktoren, die die Schwierigkeit und die Kosten beeinflussen.
Für NMR ist der wichtigste Faktor die Größe. Ein stabiles, gut erzogenes Protein von 10-20 kD ist so ziemlich Routine. Große Proteine sind mit NMR entweder sehr schwer zu messen oder gar nicht möglich.
Für Röntgen und NMR braucht man große Mengen an Protein, aber im Fall von NMR braucht man es auch isotopenmarkiert. Die einheitliche Kennzeichnung von Proteinen 15N/13C ist nicht allzu teuer, wenn Sie Ihr Protein in E. coli in Minimalmedium exprimieren können (ca. 100 $ pro Liter Medium oder so, meistens in 13C-Glukose), aber es kann sehr schnell sehr teuer werden, wenn Sie es tun brauchen volles Medium oder irgendetwas Besonderes.
Ihr Protein muss mindestens einige Tage in Lösung stabil sein, die Messung eines einzelnen 3D-Experiments kann mehrere Tage dauern. Wenn Ihr Protein kaum stabil genug ist, müssen Sie auch viel mehr Protein produzieren, weil Sie viele Proben verwenden müssen, um alle notwendigen Experimente durchzuführen. Eine Komplikation dabei ist, dass man einer NMR-Probe nicht viel Salz hinzufügen kann, ohne die Empfindlichkeit der NMR-Experimente drastisch zu reduzieren. Aber einige Proteine sind in einer salzarmen Umgebung nur schwer stabil zu bekommen.
Sie benötigen etwa einige Wochen Messzeit an einem Hochfeld-NMR-Spektrometer, was jedoch stark von der Größe des Proteins und der Konzentration, die Sie in Ihrer Probe erreichen können, und der allgemeinen Schwierigkeit, die Proteinresonanzen zuzuordnen, abhängt. Diese Art von Spektrometer kann einige Millionen kosten, und Sie müssen flüssigen Stickstoff und flüssiges Helium liefern, damit sie funktionieren. So etwas wie eine Messzeit von 1000 US-Dollar pro Tag ist eine Zahl, die ich über die Kosten gehört habe, aber es spielen viele Faktoren eine Rolle, und ich kann nicht sagen, wie genau diese Zahl ist.
Dann müssen Sie die Resonanzen in Ihrem Protein zuordnen, was eine einzelne Person mehrere Monate dauert. Dies variiert wiederum stark je nach Schwierigkeitsgrad.
Dann müssen Sie die Struktur berechnen, und normalerweise erfordert dies mehrere Runden, um die Zuordnung und Analyse zu verfeinern und die Berechnungen zu wiederholen. Es ist nicht wirklich teuer in Bezug auf die Computerleistung, aber es erfordert einiges an Arbeit von der Person, die die Berechnungen durchführt und sie überprüft.
Jeppe Nielsen
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Joe
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Joe Healey