Wie hängt die hohe Genauigkeit der DNA-Replikation von der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen ab?

DNA-Polymerase muss die Addition von 4 verschiedenen Nukleotiden an den wachsenden Strang katalysieren. Dies bedeutet, dass es nicht direkt bestimmen kann, welche Base an einem bestimmten Punkt eingebaut werden soll (wie würde es „wissen“, welche Base eingebaut werden soll, und wie würde es seine Spezifität für verschiedene Basen ändern). Das bedeutet, dass die Spezifität dafür, welches Basenpaar eingebaut werden soll, vom Matrizen-DNA-Strang abhängt.

Die richtige Watson-Crick-Basenpaarung (d. h. Wasserstoffbrückenbindung) zwischen dem Matrizenstrang und dem einzubauenden Nukleotid löst das Schließen der Fingerdomäne von DNAP um die Primer-Matrizen-Verbindung aus und positioniert letztere in der optimalen Position für die Katalyse (mit Die$\ce{\alpha-PO_4}$des ankommenden Nukleotids in der Nähe der$\ce{3'-OH}$des Primers für einen durch zwei katalysierten nukleophilen Angriff$\ce{Mg^{2+}}$Ionen). Hier kommt der von Ihnen erwähnte konservierte Tyrosinrest ins Spiel. Ein falsch gepaartes Nukleotid löst diese Konformationsänderung nicht aus und wird nicht optimal positioniert, sodass eine Katalyse weniger wahrscheinlich ist.

Darüber hinaus stellt die DNA-Polymerase durch Wasserstoffbrückenbindungen Kontakte mit der kleinen Furche der Primer-Matrizen-Verbindung her. Diese Wechselwirkung ist nicht basenspezifisch (alle Watson-Crick-Basenpaare haben das gleiche Muster von Wasserstoffbrückenakzeptoren in der kleinen Furche), sondern tritt nur auf, wenn das richtige Nukleotid eingebaut wird, wodurch der Komplex stabilisiert wird.

Schließlich erfolgt die Unterscheidung zwischen Ribonukleotiden und Desoxyribonukleotiden durch sterischen Ausschluss der$\ce{2'-OH}$durch Aminosäurereste in der Bindungstasche.

Diese Faktoren können als kinetisches Korrekturlesen betrachtet werden, da sie einfach die Reaktionsgeschwindigkeit verlangsamen und einem falsch gepaarten Nukleotid Zeit zum Dissoziieren geben. Sie können jedoch immer noch eingebaut werden und viele DNA-Polymerasen haben eine$\ce{3'->5'}$Korrektor Exonuklease, die falsch gepaarte Nukleotide entfernen kann. Dieses Korrekturlesen wird wiederum durch Wechselwirkungen zwischen dem DNAP und der Primer-Matrizen-Verbindung (dh Wasserstoffbindung mit der kleinen Furche) vermittelt. Eine geschwächte Wechselwirkung aufgrund einer falsch gepaarten Base verringert die Affinität zwischen DNA und der katalytischen Stelle und erhöht die Affinität zwischen DNA und der Korrekturlesestelle (weil sie eine Präferenz für die Spaltung von ssDNA vom 3'-Ende hat).

High-Fidelity-DNA-Polymerasen verfügen über mehrere Sicherheitsvorkehrungen zum Schutz vor Fehlern beim Kopieren von DNA.

Solche Enzyme haben während der Polymerisation eine signifikante Bindungspräferenz für das richtige gegenüber dem falschen Nukleosidtriphosphat.

Wenn ein falsches Nukleotid an das aktive Zentrum der Polymerase bindet, wird der Einbau aufgrund der suboptimalen Architektur des Komplexes des aktiven Zentrums verlangsamt. Diese Verzögerungszeit erhöht die Möglichkeit für das falsche Nukleotid, vor dem Fortschreiten der Polymerase zu dissoziieren, wodurch der Prozess mit einem korrekten Nukleosidtriphosphat (1,2) erneut beginnen kann.

Wenn ein falsches Nukleotid eingefügt wird, haben DNA-Polymerasen zum Korrekturlesen eine zusätzliche Verteidigungslinie

Die durch die falsch gepaarten Basen verursachte Störung wird erkannt, und die Polymerase verschiebt das 3´-Ende der wachsenden DNA-Kette in eine Korrekturlese-3´→5´-Exonukleasedomäne. Dort wird das falsche Nukleotid durch die 3´→5´-Exonuklease-Aktivität entfernt, woraufhin die Kette zurück in die Polymerase-Domäne verschoben wird, wo die Polymerisation fortgesetzt werden kann.

Von: New England Biolabs:

https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/polymerase-fidelity-what-is-it-and-what-does-it-mean-for-your-pcr

Beide Sätze können aus der folgenden Erklärung verstanden werden.

In einem neu synthetisierten DNA-Strang bildet die DNA-Polymerase jedes Mal, wenn ein neues Nukleotid hinzugefügt wird, ausgedehnte Wasserstoffbrückenbindungen mit der neu hinzugefügten Base. (Erster Satz) Polymerase bildet auch Bindungen mit dem DNA-Rückgrat von Phosphat und Zucker. (Zweiter Satz)

Der erste Satz spricht davon, wie Polymerase Bindungen über die kleine Furche der neu synthetisierten DNA bildet. Im zweiten Satz geht es um die Veränderung einer Aminosäure durch die DNA-Polymerase (die für die Bildung von Bindungen mit dem DNA-Rückgrat wichtig ist). Diese Änderung der Aminosäure führt zu Fehlern im hinzugefügten Nukleotid (da die Polymerase nicht richtig positioniert ist, was Sie in der folgenden Erklärung verstehen werden).

Diese Bindungen von Polymerase und Basen zusammen mit den Bindungen zwischen dem DNA-Rückgrat und der Polymerase positionieren die DNA-Polymerase.

Wenn ein neu hinzugefügtes Nukleotid korrekt mit Basen gepaart ist, wird die Struktur der gepaarten Basen so sein, dass die zwischen Polymerase und Base gebildeten Bindungen eine Positionierung der DNA-Polymerase für die Addition des nächsten neuen Nukleotids ermöglichen. Wenn ein falsches Nukleotid hinzugefügt wurde, positioniert die DNA-Polymerase so, dass ihre Exonukleasestelle an einer Position ist, um die Exonukleaseaktivität zu katalysieren.

Somit werden die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der Base und der Polymerase für die korrekte Positionierung der Polymerase benötigt, um entweder das Hinzufügen des nächsten Nukleotids zu ermöglichen (wenn die richtige Base hinzugefügt wurde) oder die Exonuklease-Aktivität der Polymerase zu ermöglichen (wenn eine falsche Base hinzugefügt wurde). Dies hilft beim Korrekturlesen und sorgt so für hohe Wiedergabetreue.