Wie signifikant ist der RNA-Abbau mit der Entfernung von Cap/PolyA's in Eukaryoten oder UTR's in Prokaryoten?

Die Frage ist ziemlich selbsterklärend, aber in zwei Teile unterteilt. Ich versuche, ein Repressionssystem zu verwenden, das RNA an bestimmten Stellen mit Ribozymen spaltet, um sie abzubauen (oder einfach zu inaktivieren).

Dieses Szenario scheint bei Eukaryoten wahrscheinlicher zu sein, da sie 5'-UTRs und einen PolyA-Schwanz bei 3'-UTRs, die RNA-Stabilität verleihen, mit einer Kappe versehen haben. Wie schnell und wie stark wird eine ungecappte RNA abgebaut? Was ist mit dem Fehlen eines PolyA-Schwanzes?

Da Prokaryoten diese Strukturen fehlen, bin ich in meinem speziellen Fall auf die Verwendung von UTR-Regionen beschränkt. Gibt es einen ähnlichen Mechanismus, ob allgemein oder für bestimmte Proteine, der es mir ermöglicht, eine UTR-Region für die RNA-Inaktivierung in Prokaryoten zu nutzen? Bitte denken Sie daran, dass das Hinzufügen synthetischer Sequenzen zu diesen UTR-Regionen sicherlich eine Möglichkeit ist.

Sie können Riboswitches verwenden. Es wurde gezeigt, dass kleine RNAs die RNA-Stabilität auch in Prokaryoten beeinflussen, aber ich denke, dass sie im Gegensatz zu Eukaryoten eine stabilisierende Rolle spielen.
Der PolyA-Schwanz hat in Bakterien eine andere Funktion als in Eukaryoten, in Bakterien scheint der PolyA-Schwanz den RNA-Abbau auszulösen, nicht zu verhindern. Ich habe nie versucht, Bakterien mit mRNA zu transformieren, aber ich habe Mäusen viel mRNA injiziert, und die Kappe und der Schwanz sind entscheidend für die Expression, wenn sie fehlen, wird die RNA normalerweise zu schnell abgebaut, um Protein nachzuweisen, zumindest in mein Biolumineszenz-Imaging-Assay.

Antworten (1)

Die Entfernung der 5'-Kappe ist für den Abbau durch 5'→3'-Exonukleasen wie Xrn1/2 wesentlich. Xrn1/2 ist konstitutiv und der Abbau von RNAs ohne Kappe wäre ziemlich schnell (keine Referenz für die genaue Lebensdauer). Die Deadenylierung geht im Allgemeinen dem 3'→5'-Abbau durch das Exosom voraus, aber ich bin mir nicht sicher, ob dies eine Voraussetzung ist. Schwanzlose mRNAs können jedoch stabilisiert werden, indem Pab1p (Poly-A-Bindungsprotein) an die 3'UTR gebunden wird. Siehe dieses Papier.

Abbildung 4 des verlinkten Artikels.

    Figur 4

Angebundenes Pab1p stabilisiert mRNAs, die keinen Schwanz erhalten. (Eine Strategie. Das selbstspaltende HDV-Ribozym wurde in die 3'-UTR von MFA2/MS2-RNA eingefügt, was in vivo eine mRNA ohne einen Poly(A)-Schwanz (A0) ergab. (B) Oligo(dT)-Cellulose-Chromatographie. RNAs wurden aus Zellen extrahiert, die das Ribozym enthaltende Konstrukt trugen, das in A dargestellt ist, oder das Kontrollplasmid, das in den vorherigen Figuren verwendet wurde. RNAs wurden durch Oligo(dT)-Cellulose-Chromatographie fraktioniert und dann durch Northern-Blotting analysiert. Die Ribozym-enthaltende RNA wird von der Säule nicht zurückgehalten, wohingegen die Kontroll-RNA zurückgehalten wird. (T) Gesamt-RNA vor der Fraktionierung; (+) von der Spalte zurückgehalten; (−) nicht von der Spalte zurückgehalten. Die mRNA läuft etwas schneller in der Oligo(dT)-retinierten (+)-Probe als in der Gesamt(T)-RNA, da weniger RNA pro Spur geladen wird. (C) S1-Nukleaseanalyse. Das 3'-Ende von mRNA, die aus einem Stamm hergestellt wurde, der die Ribozym-enthaltende RNA trägt, wurde durch S1-Nuklease-Kartierung bestimmt. Die Position der unverdauten Sonde (65 Nukleotide) und der geschützten Spezies (43 Nukleotide) sind gezeigt. Der prominente 3'-Terminus liegt an der erwarteten Position für die Ribozym-Spaltung. (D) Zerfall von Ribozym-gespaltener RNA durch ein Transkriptions-Pulse-Chase-Experiment und Northern-Blotting. Die Umsatzrate von Ribozym-gespaltenen Reporter-mRNAs wurde in Stämmen mit (links) oder ohne (rechts) MS2/Pab1p bestimmt. Die Zeit (in min) nach der Transkriptionsrepression ist direkt oben angegeben; Halbwertszeiten sind unten. (E) Quantifizierung der Ergebnisse. Die mRNA-Mengen wurden auf das Niveau der 18S-rRNA normalisiert, am Ende jeder Spur in D. (•) MS2/Pab1p; (○) Vektor allein.

Prokaryotische UTRs haben kein allgemeines Paradigma. Um eine kontrollierte Inaktivierung einer mRNA in einem prokaryotischen System zu erreichen, können Riboschalter oder cis-repressive RNA (RBS-komplementäre RNAs) verwendet werden. RNA-gesteuerter RNA-Abbau ist auch in Prokaryoten mit dem CRISPR-Cas-System möglich. Siehe dieses Papier. Die Proteine ​​Cmr-1,2,3,4 & 6 sind für diese Aktivität erforderlich.

Wie signifikant ist der RNA-Abbau mit der Entfernung von Cap/PolyA's in Eukaryoten oder UTR's in Prokaryoten?
AntwortenHierDatenschutz-Bestimmungen1y, 0v