Wie werden Antikörper entwickelt?

Ich habe lange Zeit bei einem führenden Unternehmen für hochwertige Antikörper gearbeitet, daher werde ich versuchen, einige meiner Erfahrungen mit Ihnen zu teilen. Der Prozess der Herstellung eines hochspezifischen Antikörpers (ich werde mich auf monoklonale Antikörper konzentrieren) besteht aus drei wichtigen Teilen – Antigendesign und Immunisierung, Klonen und Subklonieren sowie Screening/Validierung. Jeder Teil ist für sich entscheidend, und je besser einer ausgeführt wird, desto höher werden Ihre Erfolgschancen nachgelagert.

Damit ein Antikörper funktioniert, muss er spezifisch an sein Ziel binden. Ich werde hier nicht auf alle Einzelheiten eingehen, da es eine gute offene Literatur zum Antigendesign gibt, aber im Grunde brauchen Sie etwas, das eine starke Immunantwort im Wirt fördert, Ihnen eine Vielzahl von Klonen zur Auswahl gibt und ist spezifisch - es sollte keine anderen Ziele außer Ihrem interessierenden Protein binden. Es sind viele Faktoren zu berücksichtigen, darunter Antigenität, Löslichkeit, einfache Herstellung (für Immunisierung und Screening), sterische Überlegungen (verdeckt ein anderes Protein oder eine andere Nukleinsäure die Zielstelle in vivo ).?), und andere. Antigene können grob in zwei Typen unterteilt werden – Peptide (typischerweise weniger als 20 oder 30 Aminosäuren) und Proteine ​​oder Proteinfragmente. Sie werden höchstwahrscheinlich mehrere Antigene ausprobieren wollen, um Ihre Erfolgswahrscheinlichkeit zu maximieren. Nachdem das Antigen synthetisiert und gereinigt wurde, müssen Sie einen Impfplan für das Priming und die Auffrischung der Tiere erstellen, dann bestimmen, wann und wie sie getestet werden (Screening) und zu welchem ​​Zeitpunkt und wie sie für die geerntet werden monoklonaler Prozess.

Als nächstes kommt der Klonprozess. Klone können durch eine Vielzahl von Verfahren erzeugt werden, von denen einige allgemein verfügbar sind, wie z. B. die verschiedenen Hybridoma-Verfahren, und einige proprietär für einzelne Unternehmen sind. Meine frühere Firma verwendete eine Mischung aus beidem, je nach Tierart, und verwendete eine wirklich coole interne Technologie, die ständig verbessert und erweitert wurde. Diese Prozesse sind sehr abhängig von der Qualität der verwendeten Materialien und dem Fachwissen der Kloner. Die eingesetzten B-Zellen (die die Antikörper bilden) müssen gemäß einer Reihe präziser Schritte geerntet, behandelt und gelagert werden, um die größtmögliche Anzahl lebensfähiger Klone zu ermöglichen. Nach Gewinnung der immortalisierten Zellen (nach Fusion mit den Myelompartnerzellen im Hybridomprozess, zum Beispiel) werden sie auf eine vorher festgelegte Zellzahl verdünnt und in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und eine Zeit lang erholen und wachsen gelassen, während der sie Antikörper in das Medium absondern. Dieses Medium wird dann schnell getestet (bevor die Zellen die Vertiefung überwuchern) und positive Vertiefungen werden zu (hoffentlich) Einzelzellsuspensionen verdünnt und subkloniert oder für später eingefroren. Der erste Test erfolgt häufig durch ELISA unter Verwendung des immunisierenden Antigens, obwohl es je nach Ihrer interessierenden Anwendung auch durch Hochdurchsatz-Screening mittels Durchflusszytometrie, Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz erfolgen kann. Nach dem anfänglichen Testen können nachfolgende Schritte des Subklonierens und erneuten Testens in einem gemäßigteren Tempo erfolgen, da die Zellen unbegrenzt eingefroren werden können, nachdem ausreichende Mengen an Antikörpern im Überstand erzeugt wurden. Dieses Medium wird dann schnell getestet (bevor die Zellen die Vertiefung überwuchern) und positive Vertiefungen werden zu (hoffentlich) Einzelzellsuspensionen verdünnt und subkloniert oder für später eingefroren. Der erste Test erfolgt häufig durch ELISA unter Verwendung des immunisierenden Antigens, obwohl es je nach Ihrer interessierenden Anwendung auch durch Hochdurchsatz-Screening mittels Durchflusszytometrie, Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz erfolgen kann. Nach dem anfänglichen Testen können nachfolgende Schritte des Subklonierens und erneuten Testens in einem gemäßigteren Tempo erfolgen, da die Zellen unbegrenzt eingefroren werden können, nachdem ausreichende Mengen an Antikörpern im Überstand erzeugt wurden. Dieses Medium wird dann schnell getestet (bevor die Zellen die Vertiefung überwuchern) und positive Vertiefungen werden zu (hoffentlich) Einzelzellsuspensionen verdünnt und subkloniert oder für später eingefroren. Der erste Test erfolgt häufig durch ELISA unter Verwendung des immunisierenden Antigens, obwohl es je nach Ihrer interessierenden Anwendung auch durch Hochdurchsatz-Screening mittels Durchflusszytometrie, Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz erfolgen kann. Nach dem anfänglichen Testen können nachfolgende Schritte des Subklonierens und erneuten Testens in einem gemäßigteren Tempo erfolgen, da die Zellen unbegrenzt eingefroren werden können, nachdem ausreichende Mengen an Antikörpern im Überstand erzeugt wurden. Je nach Ihrer interessierenden Anwendung kann dies jedoch durch Hochdurchsatz-Screening mittels Durchflusszytometrie, Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz erfolgen. Nach dem anfänglichen Testen können nachfolgende Schritte des Subklonierens und erneuten Testens in einem gemäßigteren Tempo erfolgen, da die Zellen unbegrenzt eingefroren werden können, nachdem ausreichende Mengen an Antikörpern im Überstand erzeugt wurden. Je nach Ihrer interessierenden Anwendung kann dies jedoch durch Hochdurchsatz-Screening mittels Durchflusszytometrie, Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz erfolgen. Nach dem anfänglichen Testen können nachfolgende Schritte des Subklonierens und erneuten Testens in einem gemäßigteren Tempo erfolgen, da die Zellen unbegrenzt eingefroren werden können, nachdem ausreichende Mengen an Antikörpern im Überstand erzeugt wurden.

Hier kommt die Qualität Ihres Screening-Programms ins Spiel. Ihre Assays müssen gut konzipiert, robust, gut dokumentiert und durchgeführt sein und über geeignete Positiv- und Negativkontrollen verfügen, damit Sie wirklich sagen können, ob ein bestimmter Klon von Interesse ist. oder besser abschneiden als ein bestehendes Produkt. Dies bedeutet kontrollierte Bedingungen, standardisierte Reagenzien und Protokolle sowie ein hohes Maß an Wiederholbarkeit von Assay zu Assay. Auch die Angemessenheit Ihrer Kontrollen kann nicht genug betont werden. Haben Sie eine Knockout- oder nicht-exprimierende Probe zum Vergleich oder eine Möglichkeit, die Basislinie im Vergleich zur induzierten oder gehemmten Aktivität zu betrachten? Wie können Sie bei ChIP wissen, ob der Assay funktioniert, es sei denn, Sie haben ein gutes Kontrollantikörper- und Primerpaar für Ihr interessierendes Gen? Sie können ein großartiges Ergebnis erzielen, wenn Sie einen direkten Immunpräzipitations-Western-Blot durchführen. aber immer noch nicht DNA-gebundenes Protein herunterziehen. Wenn Ihre ChIP-Methode keine saubere DNA produziert, erhalten Sie möglicherweise nie eine Bindung. Und wenn Sie nicht über geeignete Datenanalyseprotokolle mit mehreren Wiederholungsbrunnen verfügen, verschwenden Sie möglicherweise Zeit damit, Rauschen anstelle eines bestimmten Signals nachzujagen. Außerdem müssen Sie nicht nur alle Ihre Klone testen, sondern sie auch titrieren, um die optimale Arbeitskonzentration zu bestimmen. Ich habe viele Antikörper gesehen, die beim ersten Test des Supers wie Mist aussehen, aber 100- oder 1000-fach verdünnt sind sie sauber, spezifisch und immer noch stark. Seien Sie geduldig, das Testen ist eine Menge Arbeit und erfordert eine Menge Wiederholungen, um Ihre Ergebnisse zu bestätigen, aber am Ende wird es sich lohnen. Wenn Sie keine geeigneten Datenanalyseprotokolle mit mehreren Wiederholungs-Wells haben, verschwenden Sie möglicherweise Zeit damit, Rauschen statt einem bestimmten Signal nachzujagen. Außerdem müssen Sie nicht nur alle Ihre Klone testen, sondern sie auch titrieren, um die optimale Arbeitskonzentration zu bestimmen. Ich habe viele Antikörper gesehen, die beim ersten Test des Supers wie Mist aussehen, aber 100- oder 1000-fach verdünnt sind sie sauber, spezifisch und immer noch stark. Seien Sie geduldig, das Testen ist eine Menge Arbeit und erfordert eine Menge Wiederholungen, um Ihre Ergebnisse zu bestätigen, aber am Ende wird es sich lohnen. Wenn Sie keine geeigneten Datenanalyseprotokolle mit mehreren Wiederholungs-Wells haben, verschwenden Sie möglicherweise Zeit damit, Rauschen statt einem bestimmten Signal nachzujagen. Außerdem müssen Sie nicht nur alle Ihre Klone testen, sondern sie auch titrieren, um die optimale Arbeitskonzentration zu bestimmen. Ich habe viele Antikörper gesehen, die beim ersten Test des Supers wie Mist aussehen, aber 100- oder 1000-fach verdünnt sind sie sauber, spezifisch und immer noch stark. Seien Sie geduldig, das Testen ist eine Menge Arbeit und erfordert eine Menge Wiederholungen, um Ihre Ergebnisse zu bestätigen, aber am Ende wird es sich lohnen. Ich habe viele Antikörper gesehen, die wie Mist aussehen, wenn Sie das Super zum ersten Mal testen, aber 100- oder 1000-fach verdünnt sind sie sauber, spezifisch und immer noch stark. Seien Sie geduldig, das Testen ist eine Menge Arbeit und erfordert eine Menge Wiederholungen, um Ihre Ergebnisse zu bestätigen, aber am Ende wird es sich lohnen. Ich habe viele Antikörper gesehen, die wie Mist aussehen, wenn Sie das Super zum ersten Mal testen, aber 100- oder 1000-fach verdünnt sind sie sauber, spezifisch und immer noch stark. Seien Sie geduldig, das Testen ist eine Menge Arbeit und erfordert eine Menge Wiederholungen, um Ihre Ergebnisse zu bestätigen, aber am Ende wird es sich lohnen.

Schließlich, nachdem all dies erledigt ist, haben Sie hoffentlich einen großartigen Klon, der tut, was Sie wollen, und besser als alles andere da draußen. Sie müssen jetzt entscheiden, was Sie damit machen wollen, denn wenn Sie ein akademisches Labor sind und damit veröffentlichen, wird die Welt an Ihre Tür klopfen. Lassen Sie am Ende nicht nach und entscheiden Sie, dass 100 ml Überstand ausreichen werden, um ewig zu halten – bewahren Sie die Klone auf und legen Sie sie in eine Zellbank, oder versuchen Sie, einen Kommerzialisierungsvertrag mit einem Herstellerunternehmen abzuschließen, damit Sie es nicht tun müssen mach die ganze arbeit!

Ich hoffe, das hilft, bitte lassen Sie es mich wissen, wenn Sie weitere Fragen oder Bedenken haben.

Wenn Sie auf Konrads Kommentar antworten, stellen Sie das interessierende Peptid oder Protein mit Bakterien her oder synthetisieren es chemisch (chemische Synthese funktioniert im Allgemeinen nur für kurze Peptidketten. Danach erhalten Sie viele Nebenprodukte). Dieses Peptid oder Protein Ihres Interesses dient als Ihr Antigen. Sie injizieren dieses Antigen in Mäuse oder Kaninchen. Das Immunsystem des Tieres wird auf natürliche Weise eine Immunantwort aufbauen, um Antikörper dagegen zu produzieren. Die B-Zellen, die für die Produktion dieser Antikörper verantwortlich sind, können dann geerntet werden. Danach folgen Sie im Grunde dem von Matt angegebenen Protokoll.

Sie könnten sich natürlich auch dafür entscheiden, das Serum des Tieres direkt zu isolieren und zu reinigen. Dies führt jedoch zur Produktion von polyklonalen Antikörpern, die weniger spezifisch sein können als ein monoklonaler Antikörper.