Aktivität von Glucokinase

Schauen wir uns zunächst einmal an, was diese Jungs erreichen wollen: Sie wollen Bakterien verwenden, um bestimmte Produkte herzustellen. Dazu wollen sie den bakteriellen Stoffwechsel an Stellen ausnutzen, an denen keine alternativen Wege zur Verfügung stehen. Einer dieser Schritte ist der erste Schritt der Glykolyse, wenn Glucose zu Glucose-6-Phosphat (G6P) phosphoryliert wird. In Bakterien erfolgt die Phosphorylierung während des Imports von Glukose in die Zelle durch das "Phosphoenolpyruvat (PEP): Kohlenhydrat-Phosphotransferase-System", das Phosphorenolpyruvat als Phosphatquelle verwendet. Dies hat den Nachteil, dass in der Zelle fast keine freie Glukose vorhanden ist, sondern hauptsächlich G6P.

Um dieses Problem zu überwinden, exprimierte die Gruppe alternative Transporter (die Glukose in die Zelle transportieren) und Glucokinase (Glk), um den Zellen das Überleben zu ermöglichen. Dieser Schritt entkoppelte den Import und die Phosphorylierung der Glukose und führte zu freier Glukose in der Zelle. Diese freie Glukose kann nun von verschiedenen Prozessen genutzt werden. Es ermöglicht auch die Glykolyse, da das Glk die Glucose phosphoryliert, die dann in den Glykolyseweg eintritt. Das Glk wurde verschiedenen Promotoren ausgesetzt, um verschiedene Mutanten herzustellen, um zu testen, wie die unterschiedliche Expression von Glk die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflusst.

Um ein weiteres Enzym einzubringen, das ebenfalls Glucose metabolisiert, verwendeten sie Glucose-Dehydrogenase (Gdh), die von einem Plasmid mit einem starken, IPTG-induzierbaren Promotor exprimiert wurde. Sie verwendeten dann verschiedene Konzentrationen von IPTG, um die Wirkung auf die Produktion von Gluconat und die Lebensfähigkeit der Zellen zu testen (ich gehe nicht darauf ein).

Die obige Abbildung ist Abbildung 5 aus der Veröffentlichung und zeigt die Wirkung der drei verschiedenen IPTG-Konzentrationen, die verwendet wurden, um die Expression von Gdh zu induzieren. Für 10 und 25 uM IPTG wird die Ausbeute an Gluconat kleiner, je höher die Glk-Aktivität wird. Lediglich die verkleinerte Aktivität zeigt eine geringere Ausbeute. Bei der höchsten Konzentration ist das ganz anders, aber hier werden die Zellen wahrscheinlich durch die hohe Expression von Gdh (die auch viel Energie verbraucht) durcheinander gebracht.

In der Arbeit geben sie keine Erklärung oder diskutieren zumindest das Verhalten der Gluconatausbeute bei der kleinsten Glk-Aktivität (ich würde gerne die Kommentare der Gutachter dazu lesen). Aus den Daten würde ich eine höhere Produktion erwarten. Es ist möglich, dass die geringere Energieproduktion (wenig G6P bedeutet wenig Glykolyse) negative Nebenwirkungen auf die Zellen hat. Es ist auch möglich, dass Gdh bei niedrigeren Glk-Aktivitäten durch einige andere Substanzen in der Zelle gehemmt wird. Die Gdh-Aktivität wird beispielsweise durch höhere Konzentrationen von Nukleotidtriphosphaten (ATP usw.) gehemmt, siehe hier . Da Glk ATP als Cofaktor benötigt, wäre es möglich, dass sich die ATP-Konzentration bei niedrigeren Glk-Aktivitäten negativ auf die Gdh-Aktivität auswirkt (meine eigene Spekulation).

Oder es ist einfach ein Artefakt aus dem Experiment. Dies hat einige Punkte, die kritisiert werden können (ich würde gerne auch die Kommentare der Rezensenten hier sehen). Erstens sind die Fehlerbalken ziemlich groß, das kann also auch etwas anders sein. Im Text erwähnen sie, dass die Daten von erworben wurden

mindestens 2 Parallelkulturen in einem repräsentativen Versuch

Ich würde einige Wiederholungen mehr erwarten (mindestens drei unabhängige Experimente), was die Daten zuverlässiger machen würde. Dann (und dieser Punkt ist viel wichtiger) können sie die Aktivität von Glk und Gdh aufgrund von Einschränkungen im Nachweissystem nicht in derselben Kultur messen. Glk-Aktivitätsmessungen verwenden ein gekoppeltes System, das letztendlich die Konzentrationsänderung in NADH misst, während Gdh NADPH als Co-Faktor verwendet. Beide Versionen können nicht durch Messung eines Spektrums unterschieden werden, daher können Aktivitätsmessungen von Glk nur in untransfizierten Zellen erfolgen. Da der Ausdruck die Bedingungen in der Zelle ändert (und wir wissen nicht wie), würde ich zumindest eine Diskussion darüber erwarten, aber es fehlt.