Geeigneter Puffer für die Elektrophorese von DNA & Protein TBE oder TAE?

Die Frage, welcher Puffer für DNA besser ist, ist schon ziemlich alt. Beide haben ihre Vor- und Nachteile und ich zähle einige davon auf:

• TBE ist ein besserer Leiter und daher weniger anfällig für eine Überhitzung des Gels
• Borat ist ein starker Enzyminhibitor. Wenn Sie also enzymatische Schritte nachgeschaltet anwenden möchten, ist TAE die bessere Wahl
• TAE liefert eine bessere Auflösung für große Fragmente
• TBE hat eine höhere Auflösung für Fragmente <2kb, daher ist es hier besser

Beide Puffer tauchten in den 70er Jahren auf, als die Elektrophorese von Nukleinsäuren entwickelt wurde (eigentlich war sie von der Proteinelektrophorese abgeleitet) und wurden seitdem nicht wesentlich verändert oder optimiert, obwohl es eine Reihe von Nachteilen gibt: Erstens ist EDTA nicht wirklich notwendig für DNA-Elektrophorese (es ist für RNA, was auch der wahrscheinlichste Grund ist, warum es immer noch da ist). Dann ist Tris hier nicht die beste Puffersubstanz. Abgesehen davon, dass es relativ teuer ist, erzeugt es eine Temperatur-Strom-Rückkopplungsschleife, was bedeutet, dass die Temperatur umso höher ist, je höher der Strom wird. Dies führt zu einer höheren Geltemperatur mit allen negativen Auswirkungen. Weitere Einzelheiten hierzu finden Sie in Referenz 1.

Zu diesem Thema wurden einige Untersuchungen durchgeführt, und es gibt einige Vorschläge für bessere Laufpuffer (Details finden Sie in den Referenzen 2 und 3). Kurz gesagt sind dies:

• 10 mM Natriumborsäure (Na2B4O7/Borax): Trennung von DNA-Fragmenten von 100 bp-5 kbp
• 5 mM Lithiumacetat (LiOOCCH3): Trennung von Fragmenten länger als 3 kbp
• 1mM Lithiumborsäure (Li2B4O7): Trennung von kleinen DNA-Fragmenten und ssDNA

Das Borat in diesen Puffern ist immer noch problematisch im Hinblick auf eine mögliche enzymatische Hemmung, dies kann jedoch durch eine einfache Ethanolfällung der DNA überwunden werden (was natürlich auch für die Verwendung von TBE-Puffer gilt).

1. Geschichte und Prinzipien leitfähiger Medien für die Standard-DNA-Elektrophorese.
2. Natriumborsäure: ein Tris-freies, kühleres leitfähiges Medium für die DNA-Elektrophorese
3. Ultraschnelle hochauflösende Agarose-Elektrophorese von DNA und RNA unter Verwendung von niedermolekularen leitfähigen Medien

Ich habe gute Erfahrungen mit einem Lithium-Borsäure-Puffer von Faster Better Media gemacht . Ich verwende es für RNA-Gele, aber es wird für DNA-Gele beworben. Ich glaube nicht, dass es Protein tun kann, aber ich habe es nie versucht. Ich bin kein Elektriker, aber eine höhere Leitfähigkeit kann das Gegenteil von dem sein, was Sie wollen. Der Lithium-Borsäure-Puffer behauptet, eine geringere Leitfähigkeit als ein Puffer auf Tris-Basis zu haben, wodurch Sie die Spannung viel höher drehen können, während weniger Wärme erzeugt wird. Die höhere Spannung drückt die DNA schneller durch das Gel und hält die Banden schärfer. Meine RNA-Gele brauchen 30 Minuten, um zu laufen, früher dauerte es 3 Stunden. Natürlich verwendeten diese langsamen Gele einen auf MOPS basierenden Puffer und Formaldehyd, um die RNA zu denaturieren.

Grob gesagt spielt es keine Rolle, welchen Puffer Sie verwenden. Entscheidend ist der pH-Wert.

Für die DNA-Elektrophorese wird EDTA hinzugefügt, um zweiwertige Kationen zu chelatisieren, die als Cofaktoren für Nukleasen dienen. Tris ist die Basis des Puffers und wird verwendet, um den pH-Wert einzustellen. Neben Tris kann man zur Einstellung des pH-Wertes Borsäure, Essigsäure oder Phosphorsäure verwenden.

Der Pufferbereich kann durch die Henderson-Hasselbalch-Gleichung erhalten werden.

Die Wahl der Puffer hängt vom pH-Bereich, der Einfachheit der Herstellung/Lagerung und den feinen Auflösungseigenschaften und Laufzeiteigenschaften wie Erhitzen usw. ab (auch von anderen erwähnt).

MOPS ist ein weiteres Puffermittel. Ich bin mir nicht ganz sicher, warum MOPS anstelle von Tris für RNA-Gele verwendet wird; vielleicht bildet letzteres durch Mannich-Reaktion Addukte mit Formaldehyd, während MOPS diese Reaktion nicht eingehen kann. MOPS ist auch eine zwitterionische Spezies und behält einen neutralen pH-Wert bei. RNA sollte nicht bei alkalischem pH aufbewahrt werden. Bei saurem pH-Wert wird die RNA neutral und bewegt sich nicht.

Bei der Proteinelektrophorese liegen die Dinge etwas anders. Glycin-Chlorid-Puffer wird verwendet, weil er Stapeln ermöglicht.

Es gibt bereits viele großartige Antworten auf Ihre Frage, aber ich dachte, ich hätte meine Kommentare in Form einer Antwort formuliert.

Der Standard für DNA-Agarosegel ist TAE und für das Protein hängt es von der Größe des Proteins und dem verwendeten Geltyp ab! Manchmal funktioniert MOPS am besten und manchmal funktioniert Tris-Acetat am besten. Es hängt wirklich vom verwendeten Gel und auch vom Protein und seiner Größe ab. Sie müssen nur mit ihnen experimentieren und sehen, was für Sie am besten funktioniert! Dieses Dokument von Invitrogen könnte hilfreich sein. Um eine Überhitzung des Geräts zu vermeiden, stellen Sie es in einen kalten Raum. Auf Wunsch kann ich Ihnen meine TAE-Komponenten geben!

TAE ist der Standard-DNA-Agarose-Gelpuffer nach Sambrook et al., 1989 und wird von praktisch jedem Wissenschaftler, den ich kenne, zum Laufenlassen von Agarose-Gelen für DNA verwendet. Bitte sehen Sie sich Abbildung 2 an , um das beste Gel für Ihr gewünschtes Protein zu finden, das in Form einer Tabelle gezeigt wurde.