Ich überprüfe gerade den Artikel „Glycophorin A Dimerization Is Driven by Specific Interactions between Transmembrane Alpha-Helices“. Es gibt eine Aussage in der Zusammenfassung, die ich nicht verstehe:
"Die interessierende Transmembran-Alpha-Helix-Domäne ist mit dem C-Terminus der Staphylokokken-Nuklease fusioniert. Die resultierende Chimäre kann in Escherichia coli in hohen Konzentrationen exprimiert werden und ist leicht zu reinigen."
Wie ich es verstehe, beschreibt dies, dass eine Alpha-Helix in Glycophorin A mit der Straphylococcus-Nuklease fusioniert ist? Wie kommt dann Escherichia coli in die Diskussion und was bedeutet es, leicht gereinigt zu werden?
Im Grunde konstruierten sie einen Vektor, der, wenn er in E. coli transfiziert wird, Transkripte von – und somit Proteine für – ein Fusionsgen produziert, das diese Transmembran-α-Helices produziert, die mit der Staphylokokken-Nuklease konjugiert sind. Mit anderen Worten, die E. coli sind nur Fabriken zur Herstellung von Proteinen:
Expression, Extraktion und Reinigung von SN/GpA – Für eine hohe SN/GpA-Produktion wurde pT7SN/GpA in E. coli MGT7 (freundlicherweise bereitgestellt von D. LeMaster) transformiert, das das Plasmid pLYS-S enthält.
Und die Begründung darin wurde in der Diskussion vorgeschlagen,
Wir berichten hier über die Verwendung eines chimären Proteins, um zu zeigen, dass das Vorhandensein nur der Transmembrandomäne von GpA, fusioniert an ein normalerweise monomeres lösliches Protein, ausreicht, um die Dimerisierung dieses künstlichen Membranproteins in SDS zu vermitteln
Was sie mit leicht zu reinigen meinen, ist, dass das Protein relativ einfach extrahiert werden kann, und in der experimentellen Methode erklären sie einige gängige Reinigungsmethoden:
Eine einstufige Reinigung von Milligrammmengen von SN/GpA aus dem Extrakt konnte durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Acetonitril/Isopropylalkohol/Wasser-Gradienten auf einer semipräparativen Vydac-C4-Säule erreicht werden. Alternativ wurde die Reinigung größerer Mengen durch zwei Runden Kationenaustauschchromatographie erreicht ...
...Die Chimäre SN/GpA131, aber nicht verkürzte Formen, könnte alternNaCl, 50 mM Tris-HC1, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,025 % NaNa, nativ durch Beschallung des Pellets nach Zelllyse in 1 M pH extrahiert werden 7.9, ohne Reinigungsmittel. Diese Extraktion war von ähnlicher Effizienz wie die mit Lubrol und wurde bei der Herstellung von Material zur Erzeugung von Transmembranpeptiden durch Trypsinbehandlung verwendet.