Klärung der Verfahren zur Amplifikation von cDNA erforderlich

Das typische Verfahren zur Gewinnung von cDNA aus genomisch extrahierter DNA ist das folgende:

RNA wird aus dem gewünschten Gewebe extrahiert, RNA/DNA-Hybrid wird durch Reverse Transkriptase RNA-abhängige DNA-Polymerase erhalten, H-RNAse erzeugt Lücken in der RNA des DNA/RNA-Hybrids und mit Hilfe einer typischen DNA-Polymerase wird dsDNA transkribiert, richtig?

Dann ist die neu synthetisierte cDNA linear (wie ein "kleines Chromosom")? Wie wird es vor der nukleolytischen Aktivität geschützt? Ist das Verfahren wirklich so, wie ich es beschrieben habe, oder ergibt die Reverse Transkriptase bereits eine dsDNA aus einzelsträngiger mRNA?

Antworten (1)

Hier ist das grobe Verfahren, das ich zuvor zur Herstellung von cDNA verwendet habe

  1. Extrahieren Sie RNA aus dem gewünschten Gewebe (wählen Sie nach mRNA, indem Sie den PolyA-Schwanz der mRNA verwenden)
  2. Reverse Transkription durchführen. Dies erfordert einen zum polyA-Schwanz komplementären Primer, um die reverse Transkriptase zu starten ( Bearbeiten : Sie könnten auch zufällige Primer verwenden, um die reverse Transkription zu starten. Dadurch wird die redundante polyT-Sequenz aus der cDNA entfernt. Dies ist die Methode, die im Illumina TruSeq-Hochdurchsatz verwendet wird Sequenzierungsbibliothek-Vorbereitungskit). Jetzt haben Sie eine Sammlung von hybriden RNA/DNA-Doppelsträngen
  3. Verdauen Sie den RNA-Strang spezifisch. Dies kann, wie Sie bereits erwähnt haben, mit RNAse H oder durch Einführung basischer Bedingungen erreicht werden, die RNA aufgrund des 2'OH von RNA viel schneller abbauen als DNA. Jetzt haben Sie lineare ssDNA, die komplementär zu den anfänglichen mRNA-Vorlagen ist.
  4. Ab diesem Zeitpunkt können Ihre Anwendungen abweichen. Wenn Sie Mikroarrays durchführen, benötigen Sie lediglich ssDNA, da Sie die cDNA an das Array hybridisieren möchten. Wenn Ihre nachgelagerte Verwendung der cDNA dsDNA erfordert, müssen Sie einen komplementären Strang zur cDNA synthetisieren (und möglicherweise das Produkt amplifizieren). Dies kann durch zufällige PCR-Primer oder etwas kompliziertere PCR erreicht werden, die zusätzliche Sequenzen auf beiden Seiten Ihrer cDNA enthalten (z. B. Barcodes und Adapter in RNA-Seq).

Wie wird [die cDNA] vor der nukleolytischen Aktivität geschützt?

Wenn Sie das Produkt der reversen Transkription mit RNAse H verdauen, verdaut dieses Enzym RNA spezifisch, sodass Ihre DNA unversehrt bleibt. Wenn Sie eine Behandlung unter alkalischen Bedingungen durchführen, wird die RNA unter diesen Bedingungen viel schneller abgebaut als die DNA, da die 2'-OH-Gruppe in der RNA vorhanden ist, die als Nukleophil für eine Selbstspaltungsreaktion wirken kann.

Die cDNA wird also einen Pol-Schwanz haben?
Es hängt davon ab, ob. Wenn Sie nur einen Strang haben und mit PolyA-Schwänzen grundieren, dann ja. Wenn Sie jedoch einen zweiten Strang synthetisieren, haben Sie einen Doppelstrang mit einer Seite PolyA und einer Seite PolyT. Ich habe auch nachgesehen, wie das Illumina TruSeq-Bibliotheksvorbereitungskit dies tut, und sie verwenden zufällige Primer, um die Reverse Transkriptase zu primen. Wenn Sie das also tun würden, hätten Sie nicht unbedingt einen PolyT-Schwanz auf Ihrer Erststrang-cDNA. Dies ist sinnvoll, wenn Sie die Menge an informativer (dh Nicht-PolyA/T)-cDNA maximieren möchten, beispielsweise für RNA-Seq.
Klärung der Verfahren zur Amplifikation von cDNA erforderlich
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