Ich lese die ENCODE-Papiere durch, was mich in Bezug auf moderne Labortechniken weit aus meiner Komfortzone herausholt. Auf die Gefahr hin, eine Frage zu stellen, die woanders im Internet durchaus ausführlich beantwortet werden könnte, hoffte ich auf eine kurze Erklärung der Kerntransfektion.
In Whiteld et al . beschreiben sie den direkten Assay der Wirksamkeit der Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle in menschlichen Zellen. Dazu transfizieren sie ein Luziferase-Plasmid, vermutlich in den Zellkern (weil sie anschließend beobachten, dass das Luziferase-Plasmid transkribiert wird).
Sie lasen die Materialien und Methoden durch und gelangten zur ergänzenden Akte, sie legten ihr Transfektionsprotokoll offen. Die relevanten Reagenzien scheinen zu sein:
FuGen 6
eine nicht-liposomale Formulierung, die entwickelt wurde, um Plasmid-DNA mit hoher Effizienz und geringer Toxizität in eine Vielzahl von Zelllinien zu transfizieren.
(Von Promegas Website.)
Lipofectamin LTX
effizientes Reagenz für Plasmidtransport und Proteinexpression
(Von der Website von Invitrogen.)
PLUS-Reagenz
PLUS™-Reagenz wird in Verbindung mit Transfektionsreagenzien wie Lipofectamine™ verwendet, um die Transfektion in adhärenten Zelllinien zu verbessern.
(Von der Website von Invitrogen.)
Anscheinend besteht das Protokoll darin, das DNA-Plasmid mit dem Transfektionsreagenz zu kombinieren, einige Minuten zu warten und dann die Zellen hinzuzufügen und 24 Stunden bei 37 ° C zu inkubieren. Das ist alles, was erforderlich ist, um das Plasmid in den Zellkern zu bringen.
Ich habe Wikipedia und Strachan and Read's Human Molecular Genetics 4th edition konsultiert, konnte aber meine Frage zu dieser Technik nicht beantworten.
Ich denke, ich habe ein ziemlich klares Verständnis dafür, wie diese Reagenzien in der Lage sind, durch die Lipidmembran der Zelle zu gelangen, aber ich habe kein ähnliches Verständnis dafür, wie die DNA dann zum Zellkern gelangt .
In Human Molecular Genetics, 4. Auflage, finde ich nur einen Absatz über den Plasmidtransfer durch eine Kernmembran, Seite 704: „Der Transport von Plasmid-DNA zum Kern sich nicht teilender Zellen ist sehr ineffizient, weil die Plasmid-DNA oft nicht in die Poren der Kernmembran eindringen kann Verschiedene Methoden können verwendet werden, um den Eintritt in den Kern zu erleichtern, wie z.
Aber nichts im Material- und Methodenteil von Whiteld et. all erwähnt eine dieser Techniken. Ich bin sicher, sie hätten erwähnt, ob ihr Plasmid eine DNA-Konjugationssequenz enthält, das kann es also nicht sein. Vielleicht enthalten diese Reagenzien implizit eine Art DNA-Verdichtungspolykation, wie PEG-CK30?
Ist das Zytoplasma nicht ein äußerst feindlicher Ort für DNA-Plasmide? Sollten sie nicht einfach im Zytoplasma herumwirbeln, bis sie verdaut sind?
Oder schleichen sich diese Vektoren während der Mitose in den Zellkern ein? (Dies ist eine Theorie, die mir gerade eingefallen ist, als ich über die „nicht-teilende“ Einschränkung im Strachan-Zitat nachdachte.)
Da die Frage in der Arbeit nicht behandelt wird, kann ich nur davon ausgehen, dass die Antwort elementar ist und etwas, das ein professioneller Zellbiologe wissen sollte. Ich habe keine offensichtlichen nächsten Schritte mehr, um die Antwort zu finden, also bitte ich im Voraus um Verzeihung, dass ich danach gefragt habe.
Mein Versuch, eine Antwort zu finden, hat darauf hingedeutet, dass niemand weiß, wie die DNA in den Zellkern gelangt.
Diese ziemlich neue Veröffentlichung berichtet über Versuche, den Weg des DNA-Eintritts und -Transfers zum Zellkern zu verfolgen.
Le Bihan et al . (2010)Untersuchung des In-vitro-Wirkungsmechanismus von kationischen Lipid/DNA-Lipoplexen im Nanometerbereich. Nukl. Säuren Res. 39 : 1595-1609
Die verwendete Technik war die Transmissionselektronenmikroskopie. Komplexe aus Plasmid-DNA + kationischen Lipiden (Lipoplexe) wurden mit Silica-basierten Nanopartikeln markiert, um eine Visualisierung zu ermöglichen.
Die Autoren beschreiben einen Transfektionsweg mit fünf Schritten:
(i) Bindung der Lipoplexe an die Zelloberfläche;
(ii) Eintritt der Lipoplexe in die Zellen hauptsächlich über Endozytose (eine direkte Verschmelzung mit der Zellmembran kann nicht ausgeschlossen werden);
(iii) DNA-Freisetzung in das Cytosol;
(iv) Transport durch das Zytosol; und
(v) Eintritt von DNA in den Kern und Kerntranskription.
Die Autoren konnten jeden der ersten vier Schritte nachvollziehen, aber:
Unsere Daten zeigen Nanopartikel in der Nähe, aber nicht innerhalb des Zellkerns.
Sie spekulieren darüber, was dies bedeuten könnte, beziehen sich aber nicht auf zuvor veröffentlichte Daten. Meine Schlussfolgerung ist, dass die Antwort auf Ihre Frage, wie ich zu Beginn meiner Antwort sagte, lautet: Niemand weiß, wie die transfizierte DNA in den Zellkern gelangt.
Zabner et al . (J. Biol. Chem., 1995, 270 , 18997–19007) überwachten die Lipid-DNA-Komplexbildung und -aufnahme, von der festgestellt wurde, dass sie überwiegend durch Endozytose erfolgt. Das Dot-Blot-Experiment zeigt, dass Zellen (50 % Population) 60 % der DNA aufgenommen haben. Es wurde beobachtet, dass sich der DNA-Protein-Komplex im perinukleären Cytoplasma ablagerte und eine Reihe regelmäßig gepackter Tubuli bildete. Sie bestätigten auch, dass die Endosomen, die den Komplex tragen, nicht mit Lysosomen fusionierten.
Ein Teil der DNA entweicht dem Endosom (was ein bekannter Mechanismus zur Steigerung der Effizienz von auf Endozytose basierenden Transfektionen ist) und könnte vom Zellkern aufgenommen werden. Als sie die Expression eines Reportergens bei direkter Injektion in den Kern und bei direkter Injektion in das Zytoplasma verglichen, wurde in letzterem keine Expression beobachtet (nach Capecchi (Cell, 1980) beträgt das Expressionsverhältnis etwa 1000:1. PDF verfügbar auf der Website der Utah Uni). Dies bedeutet, dass die DNA-Aufnahme durch den Zellkern aus dem Zytoplasma sehr ineffizient ist.
Eine geringere Menge an Lipiden im Protein-DNA-Komplex erhöht die Effizienz.
Ihre Frage wurde teilweise beantwortet. Wie gelangt all die DNA, die die Zelle aufnimmt, in den Zellkern? Meistens nicht. Es reichert sich um den Zellkern an. Aber ein Teil der freien DNA wird vom Zellkern aufgenommen. Dies war wahrscheinlich der Ausgangspunkt für Deans Gruppe.
Vaughan & Dean (Mol.Ther., 2006, 13(2) 422-428) haben vorgeschlagen, dass die Plasmide mit Hilfe des mit Mikrotubuli assoziierten Motorproteins Dynein in den Zellkern transportiert werden. Sie beobachteten, dass die Störung der Mikrotubuli-Netzwerkfunktionalität die Expression hemmte. Wenn die Plasmide direkt in die Zellkerne injiziert wurden, hatte dies keine Wirkung. Nun transportieren Mikrotubuli Stoffe mit Hilfe von Motorproteinen, aus denen Dynein Stoffe zum Zellkern transportiert. Es wurde beobachtet, dass die Hemmung der Dynein-Wirkung die Expression verringerte. Der Mechanismus, wie Dynein an Plasmid bindet, ist unbekannt. (Ich habe mit Dynein gearbeitet; es ist kompliziert, wenn es um Bindungsmechanismen geht. Der gesamte negativ geladene N-Terminus ist ungeordnet.)
Wenn Sie die Diskussion des Papiers lesen, wird deutlich, dass der Prozess chaotisch ist. Je mehr DNA im Zytoplasma um den Zellkern verteilt ist, desto mehr wird sie vom Zellkern aufgenommen.
Hier ist kein nukleares Lokalisierungssignal beteiligt. Mesika et al . (Human Gene Ther., 2005) haben die Effizienz der Plasmidexpression gesteigert, indem sie die Plasmide mit NLS an ein Protein gebunden haben. Dies ist nicht der natürliche Prozess. Vaughan und Dean haben spekuliert, dass die DNA-Targeting-Sequenz ( z . B. SV40, CMV usw.) an Proteine bindet, die NLS haben oder Adapter haben, um Dynein (wie Transkriptionsfaktoren) zu binden, was die Aufnahme des Plasmids durch den Zellkern unterstützen könnte. Dies kann auch die sequenzbasierte differentielle Aufnahme von Plasmiden erklären. Keiner dieser Mechanismen wurde experimentell verifiziert.
[Das habe ich mich auch schon gefragt. Ich habe viele Senioren abgehört und das Netz nach Antworten durchforstet. Und dann fand ich diese Frage. Danke für die Nachfrage]
Diese Frage taucht immer wieder auf, wenn Doktoranden oder Postdocs über die Transfektion diskutieren. Eine wahrscheinliche Antwort, für die ich keine unterstützende Literatur habe, lautet wie folgt: Wenn Sie den Transfektionskomplex im Medium haben, während sich die Zellen teilen, ist es möglich, dass sie nach der Mitose in den Kern eindringen können, wenn sich die Kernmembran noch bildet, und somit geben es Zugang zum Transkriptionsmechanismus im Zellkern.
Maurer
Benutzer137