Primer-Design für die Gibson-Montage

Ich versuche, eine Grundierung für die Gibson-Montage zu entwerfen . Mein interessierendes Gen befindet sich auf einem Plasmid, und ich möchte dieses Gen kopieren und in ein anderes Plasmid einfügen.

Ich bin mir nicht sicher, wie ich meine Primer für die PCR entwerfen soll. Ich weiß, dass ich 2 Sätze Primer brauche (insgesamt 4).

  1. Rückwärts- und Vorwärts-Primer, um mein Gen aus dem Plasmid zu kopieren, das es enthält.
  2. Rückwärts- und Vorwärtsprimer zum Kopieren des Plasmids.

Ich weiß auch, dass ich komplementäre Überlappungsregionen zwischen meinem Gen und dem Plasmid schaffen muss, in das ich es einfügen möchte. Wie mache ich das?

Hier ist das Plasmid und das Gen. Ich möchte das Gen zwischen dem Biobrick-Präfix und -Suffix platzieren.

Ich glaube, ich brauche folgende Grundierungen:

Für das Plasmid, in das ich das Gen einfügen möchte, sollten meine Primer sein

  • Nach vorne:ATTCGCGGCCGCTTCTAGAG
  • Umkehren:CTGACGCGGCCGCTACTAGTA

Primer zum Kopieren von Genen und Hinzufügen von Überlappung

  • Umkehren:ATCATTTCAAATTCGTCCATCTCTAGAAGCGGCCGCGAAT
  • Nach vorne:AATTAGAAAGAGATTATAATACTAGTAGCGGCCGCTGCA

Hier ist das Gen

Hier ist das Plasmid , in das ich es einfügen möchte. Ich verwende Geneious, aber ich denke, für diesen Zweck funktioniert Word ganz gut.

Ihr Gen ist 5 kb lang. Sie können es nicht mit 4 Primern zusammenbauen. Übrigens ... warum müssen Sie es zusammenbauen? Sie können eine normale PCR durchführen. einfacher
@WYSIWYG das TyrRs-Gen ist nur 1920 bp des Plasmids in der verknüpften Datei.
@AlanBoyd ... das würde immer noch mehr als 4 Primer erfordern, um es zusammenzubauen ... Um ein ~ 320 bp-Fragment zusammenzubauen, habe ich vier 90-mere verwendet ...
Marco ... Ich denke, was Sie tun möchten, ist eine verschachtelte PCR. Bei der Gibson-Assemblierung bauen Sie das gesamte DNA-Fragment mit mehreren kleinen Oligos zusammen.

Antworten (2)

Haftungsausschluss: Ich habe noch nie eine Gibson-Montage durchgeführt, aber hier ist mein theoretisches Verständnis dafür, wie Sie Ihre Zündhütchen entwerfen. Sie benötigen vier 40-mere, die jeweils aus 20-bp-Segmenten bestehen, die aus dem Vektor und dem Insert stammen und den Verbindungen entsprechen, die Sie zu erstellen versuchen. In dem Diagramm unten stellen die gepunkteten Linien die Verbindungen zwischen den zwei 20-bp-Segmenten jedes 40mers dar.

Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Hier ist ein guter Überblick über Überlegungen zum Zündhütchendesign bei der Verwendung der Gibson-Montage. http://j5.jbei.org/j5manual/pages/22.html

Es heißt, dass das Plasmid durch Schneiden linearisiert werden kann, sodass Sie nur 2 Primer benötigen, um das Insert zu klonen. Welchen Vorteil hat es, den Vektor auch zu klonen? Ich denke, es spart einen Miniprep, aber 2 Oligos kosten mehr als ein Miniprep.
Nun, der Nachteil beim Schneiden des Vektors ist, dass an der Verbindungsstelle bereits eine Restriktionsstelle vorhanden sein muss. Dies ist eine große Einschränkung, die Gibson überwindet. Die potenziellen Nachteile der Verwendung von PCR zur Amplifikation des Rückgrats: Sie könnten Probleme haben, PCR zum Laufen zu bringen (immer ein potenzielles Problem), und es besteht ein minimales Risiko, während der PCR Mutationen einzuführen (aber Phusion-Polymerase sollte sehr wenige Mutationen ergeben).
Die meisten Vektoren haben bequeme Schnittstellen, aber ich kann sehen, dass dies in vielerlei Hinsicht bequem ist, und es wäre schnell, neue Oligos für den Vektor zu bestellen. Ich möchte das wirklich im Labor ausprobieren ...
@MarkB könnten Sie Ihren Beitrag bearbeiten , um einen Teil des Inhalts dieses Links zusammenzufassen, falls er in Zukunft nicht mehr verfügbar ist?
Dieser Link hilft bei der Beantwortung der Frage, aber bei Stack Exchange bevorzugen wir Antworten , die nicht vollständig von einem Link zu einer anderen Website abhängen
Primer-Design für die Gibson-Montage
AntwortenHierDatenschutz-Bestimmungen1y, 0v