Verfahren zur Untersuchung des Vorkommens von Nicht-Standard-Basen in Nukleinsäuren

Allgemeiner Ansatz zur Identifizierung nicht standardmäßiger Basen in Organismen

1. Reinigen Sie das Ausgangsmaterial mit Standard-Trennmethoden
2. Identifizierung mit chemischen Methoden und Vergleich mit bekannten Verbindungen
3. Legen Sie den biochemischen Syntheseweg usw. fest – die spezifische(n) Reaktion(en), die zur Herstellung (und Handhabung) der Verbindung erforderlich sind, und die Enzyme, die für die Katalyse dieser Reaktionen verantwortlich sind.
4. Identifizieren Sie die Gene für alle neu identifizierten Enzyme
5. Durchsuchen Sie die Nukleinsäuredatenbank der Genbank nach ähnlichen Gengruppen in anderen Organismen.

Anmerkungen
1 und 2. Moderne Methoden können Moleküle in kleinen Mengen in unreinen Mischungen nachweisen
3 und 4. Oft gemeinsam durchgeführt. Gene in einem kleinen viralen Genom können Möglichkeiten vorschlagen.
5. Wenn man an einem anderen Organismus arbeiten möchte, muss festgestellt werden, dass die Gene Enzyme codieren, die die Synthese der Base katalysieren.
Im Allgemeinen sind Kenntnisse in Chemie viel wichtiger als in Biologie, um solche Arbeiten ausführen zu können.

SPEZIFISCHES BEISPIEL FÜR BAKTERIOPHAGEN, DIE ADENIN DURCH 2-AMINOADENIN ERSETZEN

1. Reinigung

In diesem Fall ist die Reinigung relativ einfach. Man kann die Phagenpartikel physikalisch auf der Grundlage der Größe usw. trennen und dann die DNA aus dem Protein unter Verwendung chemischer Standardtrennungen extrahieren und sie in einzelne Komponenten, einschließlich Basen, aufbrechen (hydrolysieren). Dies wurde erstmals 1977 in Nature von Kirnos et al. .

Cyanophage S-2L wurde aus Wasserproben isoliert, die in den Außenbezirken von Leningrad entnommen wurden. Es kann Blaualgen Synechococcus sp. 698 und S. eloniatus- Stämme 58 und 6907 … Der Phage wurde auf S. sp. 698 gewaschen und durch Chromatographie an DEAE-Cellulose (Whatman DE-32) konzentriert und durch Zentrifugation im CsCl-Gradienten gereinigt.

2. Identifikation

Klassischerweise würde ein Chemiker die atomaren Bestandteile und ihr Verhältnis in einem unbekannten Molekül analysieren, einen teilweisen Abbau durchführen, um bekannte Bestandteile zu erzeugen, eine mögliche Struktur ableiten und eine Synthese versuchen, um dies zu bestätigen. Die Identifizierung unbekannter Moleküle ist im Laufe der Jahre einfacher geworden, da die Zahl der bereits identifizierten Verbindungen, mit denen man vergleichen kann, zugenommen hat (es wurde viel an kleineren Basen gearbeitet, die in Transfer-RNA gefunden wurden) und die verfügbaren Methoden gewachsen und anspruchsvoller geworden sind . Es ist interessant, dass die Cyanophagen-Arbeit in der ehemaligen Sowjetunion durchgeführt wurde, wo das Ansehen und die Finanzierung der Biowissenschaften gering waren. Standardausrüstung zur Untersuchung der spektralen Eigenschaften von Verbindungen (das Licht oder andere elektromagnetische Strahlung, die bei Anregung bestimmter chemischer Bindungen emittiert oder absorbiert wird) wäre jedoch verfügbar. Die Schlussfolgerung, dass eine unbekannte Base in der DNA dieses Phagen vorhanden war, war mit ziemlicher Sicherheit zufällig, resultierend aus einer Standardanalyse der Reinheit der DNA durch einfache Spektrophotometrie. (Proteinkontamination führt zu einer Absorption bei 260 nm.)

Es gab ungewöhnliche Merkmale in den spektrophotometrischen Eigenschaften und sogar deutlichere Änderungen, wenn die Analyse durch das Verfahren des Circulardichroismus durchgeführt wurde. Da 2-Aminoadenin zu den bereits beschriebenen und charakterisierten Basenanaloga gehörte, konnte durch Vergleich ihres physikalisch-chemischen Verhaltens festgestellt werden, dass dies die anstelle von Adenin in der Phagen-DNA vorhandene Base war.

Ich finde es im Zusammenhang mit der jüngsten Veröffentlichung ironisch, dass dieser Bericht (der von einem ausführlicheren Artikel in der Zeitschrift Virology begleitet wurde ) in den folgenden 43 Jahren wenig Beachtung fand.

3. und 4. Biochemischer Weg und Gene

Das erste der Tripletts kürzlich erschienener Science- Veröffentlichungen etablierte den Weg für die Synthese von dZTP (wobei Z 2-Aminoadenin ist), das der Vorläufer für die DNA-Synthese ist, das DNA-Polymerase-Enzym, das benötigt wurde, um diese modifizierte Base zu handhaben, und ein Enzym dATPase, die den normalen DNA-Vorläufer dATP entfernt.

Es stellte auch fest, dass vier der Gene, die diese Proteine ​​codierten, vom Phagengenom codiert werden. Die Strategie, mit der dies erreicht wurde, ist es wert, vorgestellt zu werden, da sie unter anderen Umständen verwendet wurde, um die Gene für bestimmte Reaktionen zu identifizieren. Die allgemeine Logik ist:

• Enzyme zur Durchführung von Reaktionen, die nicht vom Wirt ausgeführt werden, werden wahrscheinlich vom Phagen kodiert.
• Wir erwarten, dass ein neues Phagenenzym aus dem Erwerb eines Wirtsenzyms entsteht, das die erforderliche Reaktion durchführt, aber auf einem anderen Substrat (reagierendes Molekül), von dem wir wissen, dass es ziemlich leicht mutieren kann, um ein anderes Molekül zu binden und somit ein anderes Produkt zu ergeben. (Änderung der Substratspezifität.)
• Familien von Enzymen, die dieselbe Reaktion katalysieren, haben erkennbare Strukturmerkmale gemeinsam, sodass wir Kandidaten im Phagengenom für die interessierende Reaktion durch konzeptionelle Übersetzung in Protein identifizieren können.
• Wir können dann versuchen, unseren mutmaßlichen Kandidaten durch Expression und biochemische Assays zu testen und indem wir die Auswirkungen von Deletion oder anderer genetischer Manipulation beobachten.

Der zusammenfassende Satz für die erste Arbeit weist darauf hin, dass sie in diesem Fall ein Gen in dem Phagen gefunden haben, das auf diese Weise mit dem Wirtsgen purA verwandt ist. Das Wirtsgen katalysierte eine Reaktion des gleichen chemischen Typs wie die erforderliche, reagierte jedoch mit normalen Purinen (daher das Pur) auf dem Standardweg, und sie konnten anschließend feststellen, dass das Produkt des Phagengens (das sie purZ nannten) katalysierte die Reaktion im obigen Weg. Ein Vergleich der Chemie ist unten gezeigt.

5. Identifizierung in anderen Organismen

Man könnte natürlich nach 2-Aminoadenin suchen, indem man DNA aus anderen Phagen aufreinigt (1977 wäre dies die einzige Option gewesen), und die Autoren der jüngsten Veröffentlichung taten dies in einem Fall (die Zusammenfassung ihrer zweiten Veröffentlichung), aber sie verwendeten auch die viel schnellere allgemeine Strategie, die in der Genbank hinterlegten Phagengenomsequenzen nach Genen zu durchsuchen, die purZ (und den anderen drei erwähnten) ähnlich sind. Dies wird durch die Gruppierung (Clustering) der interessierenden Gene unterstützt – ein zusätzlicher Hinweis darauf, dass sie zusammenarbeiten. Diese Clusterbildung ist nicht immer gleich, aber das folgende Diagramm zeigt die Ähnlichkeiten zwischen mehreren Phagen und wie dies Vertrauen in das Vorhandensein des Signalwegs in anderen Phagen als S-2L gibt.

Wie alt ist das evolutionär?

Die letzte Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, wann dieser Basenwechsel in evolutionärer Zeit stattgefunden hat. Die allgemeine Strategie besteht darin, einen phylogenetischen Baum von Phagen zu betrachten – von dem allgemein angenommen wird, dass er die Phylogenie ihrer Wirtsbakterien widerspiegelt. Das Diagramm zeigt eine imaginäre vereinfachte phylogenetische Verwandtschaft. 1. Zeigt die aktuellen Arten auf der rechten Seite, mit ihrer Divergenz voneinander zu verschiedenen Zeiten in der Vergangenheit auf der linken Seite. 2. Stellt die Identifizierung von Phagen dar, bei denen die Basenveränderungen aktuell durch rote Kugeln gefunden werden, so dass in 3. durch die rote Färbung der Zweige auf den Zeitpunkt der Entstehung des Enzymsystems zur Herstellung und Verwendung der modifizierten Base in der Vergangenheit geschlossen werden kann .

Das dritte Papier macht tatsächlich so etwas und stellt fest, dass dies darauf hindeutet, dass das 2-Aminoadenin:

…wird seit der evolutionären Divergenz von Aktinobakterien, Cyanobakterien und Proteobakterien vor etwa 3,5 Milliarden Jahren von Siphoviren als Informationsträger verwendet.

Kommt das bei Bakterien vor?

Dieser Gen-Cluster wurde in keinem Bakterium beschrieben (und Sie können sicher sein, dass die Autoren der drei SciencePapiere gesichtet), obwohl man nicht ausschließen kann, dass diese Veränderung bei einigen nicht untersuchten Bakterien aufgetreten ist. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass es in bekannten Bakterien vorkommt, aufgrund der Gründe für seine Existenz in Phagen. Bakterien haben ein System zur Bekämpfung von Phagen, das als Restriktions-/Modifikationssystem bezeichnet wird. Sie kodieren spezifische Restriktionsendonukleasen, die an spezifischen Stellen in der DNA (im Allgemeinen 4-6 Basen-Pseudo-Palindrome) spalten und ihre eigene DNA schützen, indem sie Basen an diesen Stellen methylieren. In den 1980er Jahren wurde festgestellt, dass die Substitution von Adenin durch 2-Aminoadenin im Phagen S-2L seine DNA gegen viele Restriktionsendonucleasen resistent macht – dh dies ist eine virale Antwort auf das bakterielle Abwehrsystem.