Was ist der Unterschied zwischen SOLiD, 454 und Illumina Next-Gen-Sequenzierung?

Hier ist eine kurze Zusammenfassung der von Ihnen aufgeführten Sequenzierungstechnologien. Illumina ist die am häufigsten verwendete.

Die Roche/454 FLX Pyrosequencer-Technologie basiert auf der Pyrosequenzierungsmethode, die die Verwendung der Enzyme ATP-Sulfurylase und Luciferase nutzt. Nach dem Einbau jedes Nukleotids durch die DNA-Polymerase wird ein Pyrophosphat freigesetzt, das weiter an nachgeschalteten lichterzeugenden Reaktionen teilnimmt. Die Lichtmenge ist proportional zur eingebauten Nukleotidzahl. Die DNA wird fragmentiert und Adapter werden an beiden Enden ligiert. Die Fragmente werden mit Agarosekügelchen gemischt, die Adapter tragen, die komplementär zu den Bibliotheksadaptern sind, und somit ist jedes Kügelchen mit einem einzigartigen DNA-Fragment assoziiert. Die Perlen und DNA-Fragmente werden in einzelnen Micellen isoliert, wo eine Emulsions-PCR stattfindet und Millionen Kopien der einzelnen Fragmente auf der Oberfläche jeder Perle amplifiziert werden. Jede Perle wird in eine Vertiefung einer Picotiter-Platte (PTP) gegeben, da die Vertiefungen so bemessen sind, dass nur eine Perle pro Vertiefung passt. Enzyme werden zu den Kügelchen hinzugefügt und reine Nukleotidlösungen werden mit einem sofortigen Abbildungsschritt hinzugefügt. Auf einer Seite des Arrays zeichnet eine CCD-Kamera (Charge-Optic Device) das von jeder Perle emittierte Licht auf. Die ersten vier Nukleotide (TCGA) sind die gleichen wie der Anfang des Adapters, wodurch das emittierte Licht entsprechend der Art des hinzugefügten Nukleotids kalibriert werden kann. Der große Nachteil dieser Methode ist die Fehlinterpretation von Homopolymeren (aufeinanderfolgende Nukleotide, zB AAA oder CCC). Solche Bereiche sind anfällig für Einfügungen oder Löschungen, da die Länge der Strecke nur aus der Intensität des emittierten Lichts abgeleitet werden kann. Substitutionsfehler sind dagegen sehr unwahrscheinlich. Das 454 FLX-Instrument generiert ~400.000 Ablesungen pro Instrumentenlauf, da die Reads 200-400bp sind. Der größte Vorteil dieser Plattform ist die Leselänge, die die längste aller Technologien der zweiten Generation ist. Obwohl die Sequenzierung auf der 454-Plattform teurer ist als die Sequenzierung auf der Illumina-Plattform (40 USD pro Megabase gegenüber 2 USD pro Megabase), könnte sie dennoch die beste Wahl für De-novo-Assemblierungs- oder Metagenomikanwendungen sein. (Mardis, E., 2008, Shendure, J. und Ji, H., 2008).

Illumina ist die am häufigsten verwendete. Die zu sequenzierende DNA wird in etwa 200 Basenstränge fragmentiert. Adapter werden an die Enden der Fragmente ligiert und einer dieser Adapter wird auf einer Durchflusszelle hybridisiert. Illumina nutzt im Wesentlichen eine einzigartige „überbrückte“ Amplifikationsreaktion, die auf der Oberfläche der Durchflusszelle stattfindet. Es wird eine lokalisierte PCR-Reaktion durchgeführt, und jedes der hybridisierten DNA-Stücke wird lokal amplifiziert, um Cluster zu erzeugen, die genau dasselbe Molekül enthalten. Anschließend wird die DNA-Sequenz durch Hinzufügen eines Primers an einem der Enden des Moleküls bestimmt. Eine Mischung aus modifizierten Nukleotiden wird hinzugefügt. Jeder von ihnen trägt eine basenspezifische fluoreszierende Markierung. Außerdem ist bei jedem die 3'-OH-Gruppe blockiert, was den Einbau jeweils eines Nukleotids sicherstellt. Die Durchflusszelle wird unter ein Mikroskop gestellt und wenn Licht auf ihre Fluoreszenz scheint, zeigt das Emissionslicht, welche Base in jedem dieser Cluster eingebaut wurde. Die Leselänge von Illumina beträgt ungefähr 35 Basen, aber es werden gleichzeitig über Milliarden Lesevorgänge generiert. Der Hauptfehlertyp ist eher Substitution als Löschung oder Einfügung (Mardis, E., 2008, Shendure, J. und Ji, H., 2008).

Die SOLiD-Plattform nutzt die Verwendung einer DNA-fragmentierten Bibliothek, die von ligierten Adaptern flankiert wird. Die Fragmente werden an kleine paramagnetische Kügelchen gebunden, und es wird eine Emulsions-PCR durchgeführt, um die Fragmente zu amplifizieren. Im Gegensatz zu den anderen Sequenzierungsplattformen wird die Sequenzierung durch Synthese unter Verwendung von DNA-Ligase statt Polymerase durchgeführt. Jeder Sequenzierungszyklus beinhaltet die Ligation einer degenerierten Population von fluoreszenzmarkierten universellen Octamer-Primern. Eine bestimmte Position des Oktamers (z. B. Base 5) trägt eine fluoreszierende Markierung. Nach der Ligation werden Bilder in vier Kanälen aufgenommen, gefolgt von der Spaltung des Oktamers zwischen den Positionen 5 und 6, wodurch die fluoreszierende Markierung entfernt wird. Nach mehreren Runden der Oktamer-Ligation, die eine Sequenzierung jeder 5. Base ermöglichen (z. B. Basen 5, 10, 15 und 20), wird der verlängerte Primer denaturiert. Verschiedene Primer können verwendet werden, um die vorherige oder nächste Position (z. B. Base 3 oder 6) zu untersuchen. Die Plattform kann Primer verwenden, die zwei benachbarte mit Markierung korrelierte Basen tragen. Bei diesem Ansatz werden die Basen zweimal in einem Zyklus untersucht, was die Fehlerquoten verringert. Die SOLiD-Leselängen betragen 25–35 bp, und jeder Sequenzierungslauf ergibt 2–4 GB an DNA-Sequenzdaten (Mardis, E., 2008, Shendure, J. und Ji, H., 2008).

Verweise:

1. Mardis, E., DNA-Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation. Ann. Rev. Genomics Hum. Genet, 9: 387-402 (2008). DOI 10.1146/annurev.genom.9.081307.164359

2. Shendure, J. und Ji, H., DNA-Sequenzierung der nächsten Generation. Nat. Biotechnol., 26: 1135-1145 (2008). DOI 10.1038/nbt1486

Es ist nicht einfach, eine umfassende Antwort auf Ihre Frage niederzuschreiben. Ich würde vorschlagen, dass Sie dieses Papier Field guide to next generation DNA sequencers lesen , das einen sehr guten Vergleich der NGS-Plattformen bietet