In einem Pilotexperiment habe ich drei verschiedene genomische DNA-Extraktionsmethoden an dem Nicht-Modellorganismus Pieris mannii (südlicher kleiner Weißer; Insecta, Lepidoptera, Pieridae) getestet. Das Ziel bestand darin, DNA-Fragmente mit einer durchschnittlichen Länge von ≥ 30 kbp für die Bibliotheksvorbereitung für die PacBio SMRT-Long-Read-Sequenzierung (HiFi) zu generieren.
Die drei verwendeten Methoden/Kits waren: Qiagen Blood & Tissue Kit (Säulen-Assay), Beckman & Coulter DNadvance (Magnetbeads-Kit) und Standard-Phenol-Chloroform-Extraktion.
Laborgezüchtete Organismen im Präpuppenstadium (Ende der Larvenwachstumsphase, nach letzter Ausscheidung von Darminhalt, kein Chitin-Exoskelett) wurden geerntet und bei –20°C eingefroren. Für die DNA-Extraktionen wurden der Kopf und die ersten beiden Beinpaare (ca. 20 mg) geschnitten und gemäß den Kit-/Standardprotokollen mit einigen Modifikationen für DNA mit hohem Molekulargewicht verarbeitet:
| Methode | Durchschn. Bereich der DNA-Fragmentlänge (bp). | A260/280-Reihe** | A260/230-Reihe** | Nanotropfen durchschn. Konz. (ng/µl) | Qubit-Durchschn. Konz. (ng/µl) |
|---|---|---|---|---|---|
| Qiagen | 1038 - 18366 | 2.07 - 2.12 | 1,77 - 2,15 | 1151.8 | 104.9 |
| Magnetische Perlen | 7350 - 12586 | 1.98 - 2.11 | 1,60 - 1,76 | 1048.7 | 155.8 |
| Phenol-Chloroform | 19552 - 27359 | 2.03 - 2.14 | 1.94 - 2.10 | 1389.2 | 215.4 |
*bewertet mit Agilent Femto Pulse
**Nanodrop-Ergebnisse
Die DNA-Fragmente scheinen stark geschert zu sein, die Proben sind mit organischen Verbindungen kontaminiert (insbesondere mit den Magnetic-Beads) und der große Konzentrationsunterschied zwischen Nanodrop- und Qubit-Messungen kann auf eine RNA-Kontamination hindeuten.
Wie können Länge und Reinheit von DNA-Fragmenten erhöht werden? Welches sind die wichtigsten Maßnahmen? Welche Lebensphase empfehlen Sie?
Ideen:
Es ist schwierig, mit Insektenproben zu arbeiten, vor allem, weil sie eine Reihe von Polysacchariden wie Chitin enthalten , die Nukleinsäuren ähnlich genug sind, dass sie gemeinsam ausgefällt werden können. Standardextraktionsverfahren (z. B. Blut-/Gewebekits von Qiagen) handhaben dies nicht ohne einige Modifikationen, um diese Kontaminanten loszuwerden. Der schleimige Aspekt Ihrer Extraktionen ist das Ergebnis dieser Verunreinigungen.
Zu meiner Zeit (vor >20 Jahren) wurden beim Umgang mit Pflanzenproben, die mit Polyphenolen auf ähnliche Probleme stießen, Extraktionen mit modifizierten Phenol-Chloroform-Extraktionen durchgeführt. Die spezifische Form war eine sogenannte PCI (Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol)-Extraktion mit zugesetztem B-Mercaptoethanol und Polyvinylpyrrolidon in CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid)-Puffer.
Ich habe schnell nach Insekten-DNA-Extraktionen gesucht und festgestellt, dass ähnliche Protokolle für Insekten für die lange Lesesequenzierung vorhanden sind (siehe Ref. 4 im Link). Es sieht so aus, als ob SDS mit CTAB-Puffer der richtige Weg ist, gefolgt von PC- oder PCI-Extraktion .
Darüber hinaus ist die Messung von DNA- und RNA-Konzentrationen durch Spektrometrie (Nanotropfen usw.) unzuverlässig - diese Methode eignet sich hervorragend, um Informationen über DNA / RNA in Proteinlösungen (der ursprüngliche Zweck der Methode) zu erhalten, ist jedoch für DNA nicht wirklich zuverlässig genug /RNA-Quantifizierung für Gen 3-Sequenzierung (oder Gen 2 für diese Angelegenheit).
Verwenden Sie stattdessen ein Qubit- oder ein anderes Fluoreszenzverfahren zur Quantifizierung und führen Sie Ihre Proben durch einen Bio-Analyzer (Agilent) (Hochgeschwindigkeitselektrophorese, wobei Metriken für die Probe während der Analyse hinzugefügt werden).
Ich denke, die Antwort von @ bob1 ist gut und deckt viele Grundlagen ab.
Eine Sache, die meiner Meinung nach fehlt, ist jedoch die Verwendung einer Nuklearpräparation als ersten Schritt - meines Wissens nach kann dies bei vielen Problemen mit phenolischen / chitinhaltigen Verunreinigungen in schwierigen Organismen wie Pflanzen / Pilzen / Insekten helfen. Hier ist ein vorgeschlagenes Protokoll .
Ich würde auch empfehlen, zu überprüfen, was sich auf protocols.io befindet. Hier ist ein Protokoll für die HMW-DNA-Präparation von Insekten , und hier ist eine möglicherweise relevante Diskussion .
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