Ich bin etwas verwirrt darüber, was gezielte Genstörung bedeutet. Ich habe diesen Artikel gelesen, in dem sie das Genom von Pyrococcus Furiosus mit dem Genom einer genetisch lenkbaren Stammvariante von P. Furiosus, genannt COM1, vergleichen. Als sie beschrieben, wie der COM1-Stamm erhalten wurde, sagen sie:
Der COM1-Stamm wurde durch gezielte Genzerstörung des pyrF-Locus (PF1114) unter Verwendung eines Plasmids erhalten, das für Double-Crossover-Rekombination entwickelt wurde (37).
Da die Definition von Springer über gezielte Gendisruption einfach lautet:
Der experimentelle Ersatz eines endogenen Gens durch eine mutierte (nicht funktionsfähige) Version innerhalb des ansonsten unveränderten Genoms wird als gezielte Gendisruption bezeichnet.
Ich kam zu dem Schluss, dass es sich um den Ersatz des Gens, das in diesem Fall pyrF heißt, durch den Experimentator durch eine nicht funktionsfähige Version innerhalb des Genoms der genetisch manipulierbaren Variante von P. Furiosus handelt. Also dachte ich, es sei eine Art "Inaktivierung" eines Gens.
Dann in dieser Diskussion über Was ist die Beziehung zwischen einem „Hauptstamm“-Genom und seinem Variantengenom in Archaeen? , hat mir jemand freundlicherweise empfohlen, das Originalpapier darüber zu lesen, wie der COM1-Stamm entdeckt wurde. Hier finde ich einige Widersprüche zu der Idee, die ich über "gezielte Genunterbrechung des pyrF-Lokus" aufgebaut habe.
In diesem Papier sagen sie das
Bei Versuchen, ein Verfahren zum Einführen von DNA in Pyrococcus furiosus zu entwickeln, entdeckten wir eine Variante innerhalb der Wildtyppopulation, die von Natur aus und effizient für die DNA-Aufnahme kompetent ist. Eine pyrF-Gen-Deletionsmutante wurde im Genom konstruiert, und die kombinierten Transformations- und Rekombinationshäufigkeiten dieses Stamms ermöglichten den Markeraustausch durch direkte Selektion unter Verwendung linearer DNA.
Dann auch das:
Es gab keine Berichte über genetische Manipulation des P. furiosus-Chromosoms. Hier verwendeten wir Simvastatin und 5-FOA-Selektionen, um einen ΔpyrF-Stamm mit der Bezeichnung COM1 zu erzeugen
Und zum Schluss noch ein wichtiger Auszug:
Hier berichten wir über die Konstruktion einer Deletion des pyrF-Locus im Chromosom von P. furiosus und die Entdeckung, dass dieser als COM1 bezeichnete Stamm bemerkenswert effizient und von Natur aus kompetent für die Aufnahme von sowohl zirkulärer als auch linearer DNA ist.
Ich muss sagen, dass dieser Artikel zu schwierig für mich war und voller Details, die mich nicht interessieren, also habe ich ihn nicht tief gelesen, aber ich habe diese Auszüge ausgewählt, die in einfachen Worten beschreiben, wie COM1 erhalten wurde. Allerdings erhalte ich daraus eine andere Vorstellung davon, wie COM1 zustande kommt, als ich anfangs von Springer dachte.
Da die Wikipedia-Definition von Gene Deletion Mutant lautet:
In der Genetik ist eine Deletion (auch Gendeletion, Defizienz oder Deletionsmutation genannt) (Zeichen: Δ) eine Mutation (eine genetische Aberration), bei der ein Teil eines Chromosoms oder einer DNA-Sequenz während der DNA-Replikation ausgelassen wird. Es können beliebig viele Nukleotide deletiert werden, von einer einzelnen Base bis hin zu einem ganzen Stück Chromosom.
In Anbetracht dieses und der anderen beiden Extrakte, die ich berichtet habe, ist meine Vorstellung davon, wie COM1 erhalten wurde, dass das pyrF (von den Wissenschaftlern) entfernt wurde und dieser Teil (natürlich) durch einen Marker ersetzt wurde (d. h. „eine DNA-Sequenz mit a bekannter physikalischer Ort auf einem Chromosom"), das eine lineare DNA ist, da dieser COM1-Stamm bemerkenswert effizient und von Natur aus kompetent für die Aufnahme von sowohl zirkulärer DNA als auch linearer DNA ist.
Nun meine Frage: ist die Springer-Definition (oben verlinkt) "universal" oder kann man durch gezielte Gendisruption nicht nur "künstliche" genetische Manipulation beabsichtigen, sondern auch Deletion eines Gens und natürlichen Ersatz, der auch zu einem neuen pyrF-Gen führen könnte ( in diesem Fall) das ist funktionsfähig (also nicht nicht funktionsfähig)? Was bedeutet es, wenn ich sage "Der COM1-Stamm wurde durch gezielte Genzerstörung des pyrF-Locus (PF1114) erhalten"?
Ich entschuldige mich für die lange Frage und bedanke mich im Voraus.
Sie haben größtenteils Recht, aber Sie verstehen das, was hier vor sich gegangen ist, ein wenig falsch.
Die Definition von Springer ist richtig – eine gezielte Genstörung ist ein direkter Austausch des Gens durch ein nicht funktionsfähiges. Dazu benötigen Sie jedoch auch eine Methode, um festzustellen, ob Ihre Genstörung funktioniert hat und bestehen bleibt. Dies geschieht am häufigsten durch Einführen von Marker(n) zusammen mit dem zerstörten Gen in einer Form, die als Kassette bekannt ist .
In dem Fall, den Sie präsentieren, scheint Simvastatin als Selektionsmittel und 5-Fluororotsäure (5-FOA) als Reporter verwendet worden zu sein, um zu zeigen, dass das Gen zwar gestört (dh nicht funktionsfähig) ist, aber von dieser Stelle aus exprimiert wird läuft noch wie es soll.
Die Methode, mit der sie diese Kassette einführten, ist eine Rekombination zwischen einem Plasmid und dem Pyrococcus- Genom. Dies ist (oder war) eine übliche Methode zur Veränderung des Genoms vieler Organismen, um eine funktionelle Veränderung zu bewirken. Das Plasmid wird die Kassette flankierende Stellen aufweisen, die mit dem Wirt (in diesem Fall Pyrococcus- Genom) übereinstimmen, und diese werden verwendet, um das Genom dazu zu bringen, sich auf die in den Bildern hier beschriebene Weise zu rekombinieren .
Manuela