Was versteht man unter Einzelmolekülsequenzierung?

Wenn sich Sequenzierungspapiere auf die Einzelmolekülsequenzierung beziehen, was ist ihre Definition eines "Moleküls". Sagen sie Basis für Basis? Die gesamte DNA-Kette in einem Chromosom kann man sich auch als "Molekül" vorstellen. In diesem Fall ist das eine viel größere Lektüre. Was ist die Standardinterpretation?

Ist die Illumina-Sequenzierung beispielsweise ein "Einzelmolekül", da sie jeweils eine Base fluoreszieren?

Vielen Dank!

Antworten (1)

Für die klassische Sanger-Sequenzierung benötigt man recht große Mengen an DNA, um die Sequenzreaktion durchführen zu können. Dies ist ein Problem, wenn Sie das gesamte Genom sequenzieren möchten, da die DNA dann amplifiziert werden muss, was bei einigen Sequenzen Probleme verursachen, Fehler einführen oder Verzerrungen verursachen kann.

Die Einzelmolekülsequenzierung ist hier ein großer Fortschritt, da nur ein DNA-Molekül zur Sequenzierung verwendet wird. Es gibt verschiedene Sequenzierungstechnologien, die auf diesem Prinzip basieren. Das System der pazifischen Biowissenschaften verwendet eine Polymerase, die an eine kleine Vertiefung gebunden ist, die eine einzelsträngige DNA bindet und beginnt, den Gegenstrang zu bilden, wenn Nukleotide vorhanden sind. Sehen Sie sich das Bild unten oder dieses Video an, das die Technik recht gut erklärt.

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Illumina bindet einzelsträngige DNA-Moleküle an die Oberfläche der Reaktionskammer und beginnt dort, sie zu amplifizieren. Die Verwendung von fluoreszenzmarkiertem Nukleotid ermöglicht die Überwachung der Reaktion. Dies sieht wie folgt aus (linke Seite der Abbildung aus dem unten erwähnten Review):

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Eine detailliertere Illustration von Illumina finden Sie hier . Obwohl es schon etwas älter ist (und sich die Technologie schnell weiterentwickelt), ist dieser Rückblick eine schöne Einführung: „ Sequenzierungstechnologien – die nächste Generation. “

Nanoporen verwenden typischerweise ein unmarkiertes Oligo . Ihre Figur ist der immobilisierte DNA-Polymerase-Ansatz von Pac Bio, der den wunderbar benannten Zero Mode Waveguide verwendet, um ein Volumen von 20 Zeptolitern zu visualisieren und zu beobachten, wie jedes markierte Oligo von der Polymerase eingebaut wird.
Ja, das stimmt. Schauen Sie sich das Video an, es ist ungefähr die gleiche Methode.
Aber es verwendet keine Pore . Es ist ein Brunnen. Mein Kommentar war, dass ein „echter“ Nanoporenansatz wie Oxford Nano kein Etikett verwendet. Beides sind Beispiele für die Einzelmolekülanalyse.
Ich würde +1 geben, wenn Sie einen Satz über Nanoporen oder andere Einzelmolekülansätze hinzufügen und OP re Illumina beantworten.
@Chris: Für einige dieser Methoden heißt es also "1 Molekül = 1 Zählung". Sagen wir also, sie hätten eine Read-Zählung von 100 für ein Gen. Was genau bedeutet das? Es gab 100 Reads von diesem Gen? 100 Reads von Basen von diesem Gen? Etwas anderes?
@Chris Ist das dasselbe wie das, was als Sequenzierung durch Synthese bezeichnet wird?
@biogirl Ja, soweit ich weiß, ist dies einer der anderen Namen dafür.
Was versteht man unter Einzelmolekülsequenzierung?
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