Wie isoliert man zwei Plasmide aus dem E. Coli-Strang?

Ich habe eine E. coli-Zelllinie, die ich verwende, um ein Protein unter Verwendung eines Zwei-Plasmid-Systems zu exprimieren. Einer verleiht AmpR und ein KanR.

Für die Mutagenese möchte ich die Plasmide trennen, um die Effizienz der mutagenen PCR-Reaktion zu erhöhen. Ich war in der Lage, die Zellen des KanR-Plasmids zu heilen, weil es eine niedrige Kopie ist, während das AmpR eine hohe Kopie ist, so dass ich die Zellen leicht nur in Ampicillin züchten konnte und am Ende nur das AmpR-Plasmid hatte. Jedoch war ich nicht in der Lage, dasselbe zu tun, um das KanR-Plasmid zu isolieren.

Meine nächste Idee war, die Plasmide durch ein Gel laufen zu lassen und eine Extraktion durchzuführen. Da ich keinen Digest gemacht habe, war es sehr schwierig, die Bands zu unterscheiden, und ich bekam am Ende eine vernachlässigbare Ausbeute. Ich glaube, die Plasmide wurden aufgrund von Tertiärstrukturen einfach durch das Gel geschmiert.

Meine letzte Hoffnung ist es, die Plasmide mit einem Restriktionsenzym zu verdauen, das jedes Plasmid einmal schneidet. Meine Sorge ist, dass ich nicht in der Lage sein werde, die Stöchiometrie korrekt hinzubekommen, da die Plasmide beide gleichzeitig in sehr unterschiedlichen Konzentrationen vorhanden sind.

Hat jemand einen Tipp, wie ich die Plasmide sonst isolieren könnte? Oder hat vielleicht jemand Erfahrung damit, Plasmide mit unbekannten Konzentrationen zu verdauen? Ich brauche wirklich Hilfe dabei. Das Mutagenese-Projekt läuft seit Monaten und dies ist nicht einmal ein Molekularbiologie-Labor ... also zieht es die Zeit von den Hauptforschungszielen ab!

Könnten Sie nicht mit einem Restriktionsenzym verdauen, das das Amp-Plasmid einmal (oder vorzugsweise viele Male) schneidet, das Kan-Plasmid jedoch nicht schneidet? Dann könnten Sie das Ergebnis gelreinigen und umwandeln, und vermutlich wäre es fast alles Kan
@Luigi Ich denke, meine Frage wäre immer noch, wie würde Stöchiometrie funktionieren? Wenn ich irgendwo 10-50x mehr von einem Plasmid als ein anderes habe, wäre das ein großes Problem? Ich nehme an, ich könnte eine Reihenverdünnung machen ...
Ich verstehe nicht wirklich, warum Stöchiometrie hier wichtig ist. Sie haben einen Überschuss des Amp-Plasmids, aber wenn Sie alles entfernen, bleibt nur Kan. Es sei denn, ich verstehe Ihre Frage falsch
@Luigi Ich meine nur, wenn Sie einen Aufschluss oder eine Reaktion einrichten, bereiten Sie die Reaktanten in bestimmten Konzentrationen vor. Zum Beispiel sagen sie für Verdauungen eine „Einheit“ Enzym pro Mikrogramm DNA.
Meiner Erfahrung nach sind Sie wahrscheinlich in Ordnung, solange Sie sich in einer Größenordnung mit Restriktionsenzymen befinden. Da Amp im Überschuss vorhanden ist, könnten Sie wahrscheinlich mit der gesamten DNA-Konzentration arbeiten und es geht Ihnen gut. Es wäre schwieriger herauszufinden, wie viel man verwenden sollte, um das Kan zu verdauen, aber ich bin mir nicht wirklich sicher, warum Sie das überhaupt wollen
Die Gellösung ist eine gute Idee, um ein Verschmieren zu vermeiden, versuchen Sie, das Miniprep 30 Minuten lang bei 70 Grad Celsius zu erhitzen, bevor Sie es auf einem Gel laufen lassen.

Antworten (1)

Eine Rücktransformation sollte Ihnen ein reines Plasmid liefern. Verwandeln Sie den Plasmid-Mix in leere E.coli (verwenden Sie nicht zu viel DNA), plattieren Sie auf Kan / Amp, je nachdem, was Sie brauchen. Die Wahrscheinlichkeit, dass eine Zelle beide Plasmide aufgenommen hat, ist extrem gering, und Sie könnten dies mit Kolonie-PCR überprüfen, um sicherzugehen.

Ansonsten: Fragen Sie nach, es müssen (alte) Bestände der einzelnen Plasmide vorhanden sein, oder Glycerinbestände von E.coli, die nur eines der Plasmide enthalten.

Dritte Option: Schauen Sie sich Ihre Mutagenesemethode an. Für Ihre Bedürfnisse gibt es möglicherweise Techniken, die mit einer Mischung von Plasmiden funktionieren. Wenn Sie nur eine Variante oder eine Sättigungsbibliothek für eine einzelne Site benötigen, können Sie beispielsweise Quikchange verwenden. Ich sehe keinen Grund, warum dies bei einer Mischung von Plasmiden nicht funktionieren würde.

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