Ich entwerfe ein synthetisches Genkonstrukt, um Gene in E. coli zu exprimieren, die entweder von Ptet oder PLacO angetrieben werden. Das Konstrukt sähe so aus:
-Ptet-(Gen1)-PLacO-(Gen2)-
Ich möchte jedes Gen entweder mit aTc oder IPTG exprimieren, aber ich möchte sicherstellen, dass die Transkription jedes Gens unabhängig kontrolliert werden kann.
Angenommen, ich füge nur aTc hinzu und die Transkription wird an der Ptet-Position initiiert. Würde die RNA-Polymerase auf LacI stoßen, das an den PLacO-Promotor gebunden ist, und die Transkription stoppen? Oder würde es LacI transkribieren (Gen 2)? Ich bin mir nicht sicher, ob die Terminatorsequenz eingeschlossen werden muss oder nicht, um sicherzustellen, dass die Expression jedes Gens entkoppelt ist.
Gute Frage! Stellen Sie zunächst sicher, dass Sie am Ende Ihres ersten Gens mehrere Transkriptionsstopp-/Terminatorsequenzen haben. Dies ist ein ganz normales Verfahren. Auch in Ihrem Fall ist das Phänomen der Transkriptionsinterferenz (TI) praktisch. Hier ist eine Bewertung auf TI. Zusamenfassend:
der Begriff TI bezieht sich normalerweise auf den direkten negativen Einfluss einer Transkriptionsaktivität auf eine zweite Transkriptionsaktivität in cis.
Obwohl TI meistens als zwei Transkriptionsereignisse definiert wird, die sich gegenseitig beeinflussen, basiert es auf der niedrigen Ebene darauf, dass zwei Proteine, die an die DNA gebunden sind, die Aktivität des anderen beeinflussen. Da die Funktion von LacI nun darin besteht, die Transkription zu hemmen, ist es stark an die DNA gebunden, und ich würde sagen, selbst wenn eine Polymerase irgendwie durch die polyA-Signale am Ende des ersten Gens schlüpft, wird sie wahrscheinlich durch das bereits gebundene LacI gestoppt beim zweiten Promoter.
Alternativ könnte man dem ersten Gen einen schwachen Promotor entgegenstellen und seine Expression antreiben, so dass er mit der entgegenkommenden Polymerase vom ersten Gen kollidieren und sie so stoppen würde, bevor er das zweite Gen erreicht. Auch hier ist ein weiterer Artikel über TI, der ein auf TI basierendes Genregulationsnetzwerk vorschlägt.
mdperry
Nandor Poka