Zuverlässigkeit der Sanger-Sequenzierung

Als „Goldstandard“ der Sequenzierung gefeiert, fragte ich mich, was die Sanger-Sequenzierung ihrer unglaublichen Genauigkeit verdankt. Wenn möglich, hätte ich gerne eine Quantifizierung der Genauigkeit (weil ich bezweifle, dass es 100% ist, obwohl möglicherweise sehr nahe).

Ich verstehe die ddNTP-Kettenterminierung und die Strategien der Sanger-Sequenzierung, aber mir fehlt die Verbindung zur Genauigkeit.

Danke!

* Bei der Suche habe ich etwas gefunden, das als "phred-Programme" bekannt ist und frühe Konfidenzniveaus für die Sanger-Sequenzierung geliefert hat. Ich sehe jedoch nicht direkt die Korrelation zur modernen Sanger-Sequenzierung
Ich glaube nicht, dass es nur wegen seiner Genauigkeit als Goldstandard bezeichnet wird, sondern weil es praktisch die einzige Methode war, die etwa 20 Jahre lang verwendet wurde, bevor über Techniken der zweiten Generation überhaupt gesprochen wurde. Die Kettenabbruchsequenzierung ist jedoch genau und wird theoretisch nur durch die Fehlerrate der Polymerase begrenzt. Allerdings sind die Techniken der nächsten Generation auch genau.
Hier sind einige Genauigkeitsvergleiche: hindawi.com/journals/bmri/2012/251364/tab1
Danke für die Vergleiche! Ich persönlich habe gehört, dass die Sanger-Sequenzierung manchmal sogar zur Bestätigung von Next-Gen-Tests verwendet wird, und ihre Genauigkeit von 99,999 % ist wie erwartet. Aber ich stimme zu, dass sich die nächste Generation verbessert, sowohl in Bezug auf Genauigkeit als auch auf Komfort

Antworten (1)

Die Zuverlässigkeit ergibt sich aus der Tatsache, dass bei der Sanger-Sequenzierung (AFAIK) die Synthese des neuen Strangs zur Matrize und das eigentliche Ablesen der Sequenz getrennt werden. Wie Sie vielleicht wissen, verwendet Sanger seq Kapillargel elfo. Auf diese Weise werden die neu produzierten DNA-Fragmente anhand eines einzigen Nukleotidunterschieds getrennt, und das Ablesen erfolgt durch Fluoreszenzdetektoren (dann Basenaufruf usw.). Im Vergleich dazu erkennen die anderen Sequenzierungsmethoden wie Illumina und 454 jeden Nukleotideinbau, der möglicherweise weniger zuverlässige Signale erzeugt . Für zB. in Illumina-Kolonien können sich auf der Platte überlappen, oder in 454 führt der Einbau mehrerer Nukleotide in Homopolymerregionen zu einer schwierigen Entscheidung, wie viele Nukleotide tatsächlich eingebaut wurden. Außerdem muss beachtet werden, dass die Qualität der Signale/Lesungen nicht während der gesamten Sanger-Sequenzierung konstant ist. Der Anfang und das Ende der Lesevorgänge neigen dazu, verrauschte und qualitativ minderwertige Signale zu haben, sodass tatsächlich nur das 100-500(-600)bp-Segment des gesamten Fragments zuverlässig gelesen werden kann. Auch ABIs SOLID verwendet einen 2-Farben-Farbraum und jede Basis wird zweimal gelesen und ist extrem zuverlässig (99,96 % werden von den Erfindern gesagt). Auch clevere Base-Calling- und Fehlerkorrekturalgorithmen können die Genauigkeit verbessern.

Es ist bemerkenswert zu sagen, dass Sequenzer der nächsten Generation auch eine hohe Genauigkeit erreichen, indem sie ihren immersiven Durchsatz / Output nutzen – aufgrund der klonalen Amplifikation von Template-Sequenzen wird jedes Originalfragment mehrfach sequenziert und Fehler in einem einzigen Read können durch die Verwendung von korrigiert werden Andere.

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