Gendesign mit DNAWorks: Maximale Punktzahl ungleich Null?

Ich entwerfe ein Gen in DNAWorks und bin nicht in der Lage, eine Reihe von Bedingungen zu finden, die eine "Gesamtpunktzahl" von Null ergeben (auf der ich normalerweise bestehe). Personen, die DNAWorks verwendet haben: Was ist die höchste Punktzahl ungleich Null, die Sie erfolgreich zusammenstellen konnten?

Können Sie uns weitere Informationen darüber geben, was Sie zusammenbauen möchten (Größe, Länge der Überlappung, Länge der Oligos) und wie Sie es zusammenbauen wollen?
Das Gen ist ~600 bp groß. Ich bin flexibel in Bezug auf die Oligo-Länge und die Überlappungslänge, aber ich dachte an etwas wie 50-60-bp-Oligos und 15-bp-Überlappungen. Ich werde es per Gibson-Montage direkt in das Vektorrückgrat einbauen, aber das Teil ist so konzipiert, dass ich es auch auf die Standardmethode einbauen kann: zuerst das Gen per PCR zusammenbauen und dann in den Vektor ligieren. Vielen Dank!
@GerganaVandova, ich denke, dass die Frage versucht, den Designteil und nicht den eigentlichen Bauteil der Genassemblierung zu erreichen.
@bobthejoe Ich versuche zu sagen, dass der Designteil nicht der Engpass ist.

Antworten (1)

Vielleicht möchten Sie Gibsons Artikel über den schrittweisen Aufbau des mitochondrialen Genoms der Maus lesen (1) :

Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

Er begann mit 60 b langen Oligos mit 20 b Überlappung, als er 5 dieser 60-mers zu einem Rückgrat zusammensetzte und 384 b Fragmente erhielt. Im nächsten Schritt schloss er sich 5 dieser 384-Mer an und erhielt 1,2-kb-Konstrukte. Sie können dasselbe tun, aber im zweiten Schritt verwenden Sie 2x 384mere, um Ihr ~600bp-Gen zu erhalten. Gibson hat DNAWorks nicht verwendet, um die Sequenz zu zerhacken. Er hat einfach bei Basis 1 angefangen, so dass seine Fragmente F1 [1:60], F2[41:100], F3[81:140] usw. waren.

Ich denke, dass die 15b-Homologie ziemlich gering ist (Gibson verwendete 20b für den Zusammenbau der 60mere im ersten Schritt und 40bp-Homologie für die nächsten Zusammenbauten). 60b Oligo-Länge ist Standard.

Sie können auch die Ein-Schritt-Montage mit all Ihren Oligos (über PCA) wie geplant versuchen, aber ich denke, dass die Zwei-Schritt-Montage effizienter sein könnte.

Lassen Sie mich wissen, wenn Sie weitere Hilfe benötigen.

1. Gibson et al., 2009. Chemische Synthese des mitochondrialen Mausgenoms

Gendesign mit DNAWorks: Maximale Punktzahl ungleich Null?
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