Kann die Konzentration eines Proteins aus einem Gel quantitativ bestimmt werden (grobe Abschätzung)?

Ich habe ein His-getaggtes Protein in 6 M Harnstoff, 500 mM Imidazolpuffer, das vor der Dialyse quantifiziert werden muss, um sicherzustellen, dass es genug Protein gibt, das es wert ist, dialysiert zu werden. Ich habe keinen Elutionspuffer mehr, der zum Blanking verwendet werden sollte. Ich habe einen neuen Puffer mit demselben Inhalt erstellt, der mir falsche Ergebnisse lieferte. Ich könnte anhand der Messwerte, die ich in BCA- und Bradford-Assays erhalten habe, interpretieren, dass das Problem mit dem Puffer zusammenhängt (wahrscheinlich aufgrund einer Änderung der chemischen Charge). Daher ließ ich ein Gel laufen, um eine Vorstellung von der Anwesenheit von Protein zu bekommen. Gibt es Möglichkeiten, die Proteinkonzentration aus dem Gel quantitativ abzuschätzen?

Ich nehme an, Sie könnten eine Schätzung erhalten, wenn Sie eine Kalibrierungskurve mit bekannten Proteinkonzentrationen erstellen und dann versuchen, die Intensität Ihrer Unbekannten mit der Kalibrierungskurve abzugleichen. Wäre wahrscheinlich nicht sehr genau. Ich empfehle, Ihren Puffer zu fixieren und den BCA-Assay zu verwenden.
Ja, ich mache das mit einem BSA-Standard. Der BCA-Assay ergab für alle Verdünnungen negative Werte. Ich habe versucht, den Puffer zu reparieren, es konnte mir in keiner Weise helfen. Vielen Dank!

Antworten (1)

Ja, Sie können SDS-PAGE als semiquantitative Schätzung der Proteinkonzentration verwenden. Sie müssen eine Standardkurve mit einem Protein bekannter Konzentration zum Vergleich erstellen. Die Quantifizierung erfolgt durch Densitometrie. Es ist ein schneller und einfacher Vorgang, aber beachten Sie einige Einschränkungen:

  • Die Bandenintensität hängt nicht nur von der Proteinmenge, sondern auch von der Aminosäurezusammensetzung der Proteine ​​und dem verwendeten Farbstoff ab
  • Das unbekannte Protein und der Standard sollten auf demselben Gel laufen, um Variationen in Gelen, Elektrophorese, Färbung, Entfärbung und Bildgebung zu beseitigen
  • Densitometrie kann ziemlich qualitativ sein, je nachdem, wie sie durchgeführt wird

Ich bin mir nicht sicher, ob Sie nach einem Protokoll suchen, aber es ist relativ einfach. Ich lade normalerweise 2, 4, 6, 8 und 10 ul von 100 ng/ul BSA als Standard und 2, 4 und 6 ul des interessierenden Proteins (basierend auf früheren Erfahrungen mit meinen Proteinen und ihrer Reinigung). Das Gel wird mit Coomassie gefärbt und die Bandenintensität mit einem Programm namens ImageJ geschätzt. Durch Auftragen der Intensität als Funktion der Masse wird eine Standardkurve erstellt, aus der die Konzentration des Unbekannten ermittelt werden kann.

Wow! Das ist mir neu. Danke vielmals!! Funktioniert ein gescanntes Bild von Gel auf ImageJ?
@piscean_1993 Ja, aber Sie werden während des Druckens und Scannens Artefakte in das Bild einführen. Es ist wahrscheinlich am besten, es nach Möglichkeit digital zu halten.
Kann die Konzentration eines Proteins aus einem Gel quantitativ bestimmt werden (grobe Abschätzung)?
AntwortenHierDatenschutz-Bestimmungen1y, 0v